Cancer Cell:康成客戶中山大學宋爾衛組乳腺癌新成果
中山大學孫逸仙紀念醫院乳腺腫瘤中心宋爾衛教授主要從事乳腺癌的生物學特性及治療學基礎研究，在非編碼RNA調控腫瘤侵襲轉移及靶向導入小分子RNA抑制腫瘤轉移的研究方面有杰出工作。近期，宋爾衛教授課題組利用Arraystar Human LncRNA芯片發現了能抑制乳腺癌腫瘤轉移的新lncRNA分子——NKILA。NKILA能夠與經典的NF-kB信號通路相互作用，通過結合NF-kB/IkB抑制了IKK誘導的IkB磷酸化，使得NF-kB信號通路失活，從而抑制乳腺癌腫瘤轉移。該研究成果刊登在國際頂級期刊Cancer Cell（影響因子23.893）。（芯片實驗由康成提供技術服務）
研究背景
NF-kB是一個在炎癥、免疫、細胞增殖和細胞分化等過程中發揮關鍵作用的轉錄因子。NF-kB是聯系炎癥與腫瘤的關鍵分子，炎癥條件下，NF-kB組成性持續激活，促進腫瘤細胞侵襲和轉移。lncRNAs是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，無蛋白質編碼功能。近來的研究發現，lncRNA在多個層面調控基因表達，并且能夠調控腫瘤細胞增殖、凋亡、轉移、代謝、衰老和抗藥性。但是lncRNA在NF-kB信號通路和腫瘤相關的炎癥反應中的作用尚不清楚。宋爾衛教授課題組本次研究目的在于揭示lncRNA與NF-kB信號通路及乳腺癌腫瘤轉移間的關系。
研究思路
研究表明，炎癥因子能夠激活乳腺癌細胞中的NF-kB信號通路。作者利用Arraystar Human LncRNA芯片檢測多種炎癥因子((TNF)-a, IL-1b 和LPS)處理的乳腺癌細胞(MDA-MB-231)。與PBS處理的對照組比較，炎癥因子處理的乳腺癌細胞中分別有23個上調10倍的lncRNAs和28個下調10倍的lncRNAs。其中，NKILA在三組炎癥因子處理中均上調12倍以上，并且Northern blot和RT-PCR證實NKILA在炎癥因子處理的乳腺癌細胞中顯著增加。作者隨后利用一系列生物學手段對NKILA的特征進行揭示：5’-和3’-RACE實驗獲得NKILA全長序列；序列分析顯示NKILA不具有編碼蛋白質的能力；熒光原位雜交(FISH)結合共聚焦實驗顯示NKILA主要定位于細胞質，并通過核質分離實驗得到驗證。
對于NKILA的功能，體外細胞實驗顯示，在乳腺癌細胞中NKILA能夠顯著促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲，這與NF-kB抑制細胞凋亡、促進腫瘤侵襲的功能相反。體內動物實驗顯示，對于異種移植乳腺癌細胞的小鼠模型，過表達NKILA能夠降低NF-kB活性，抑制腫瘤轉移，小鼠生存時間長；反之，沉默NKILA能夠增加NF-kB活性，促進腫瘤轉移，小鼠生存時間短。
為了研究NKILA與NF-kB信號通路的關系，作者分別利用RNA-IP、RNA pull-down、RNA EMSA、蛋白-RNA結構分析、熒光素酶報告基因、ChIP和EMSA等實驗進行探索。數據表明NF-kB能夠結合NKILA啟動子，促進NKILA基因表達。在轉移性乳腺癌中高表達的miR-103/-107能夠快速降解NKILA，抵消NF-kB對NKILA的促進作用。同時，作者發現NKILA可結合NF-kB/IkB形成穩定的復合物，并直接遮蓋IkB的磷酸化motif，由此抑制了IKK誘導的IkB磷酸化以及NF-kB激活，形成負反饋。
作者進一步利用多達上千例的乳腺癌臨床標本研究NKILA的臨床意義。原位雜交實驗顯示，NKILA在癌旁組織中高表達，在低轉移的乳腺癌組織中表達降低，在高轉移的乳腺癌組織中表達水平最低。RT-PCR結合生存曲線表明，高表達的NKILA與乳腺癌患者的不良預后密切相關，可以作為潛在的乳腺癌預后生物標記物。
技術路線
結果展示
圖A. RT-PCR驗證結果顯示NKILA在三種炎癥因子處理的乳腺癌細胞中表達水平顯著升高，與芯片數據相符；
圖B. RT-PCR結合預后K-M曲線，顯示NKILA高表達與乳腺癌預后不良密切相關；
圖C. 圖示miR-103/-107與NKILA的結合位點，熒光素酶報告基因實驗確認miR-103/-107調控NKILA表達水平。
圖D. 模型展示：在轉移性乳腺癌中，NF-kB活性高，促進NKILA表達；而在轉移性乳腺癌中高表達的miR-103/-107能夠快速降解NKILA，抵消NF-kB對NKILA的促進作用。
研究意義
該研究首次揭示了lncRNA與NF-kB信號通路的關系。轉錄因子NF-kB通過結合NKILA啟動子，促進NKILA基因表達。在轉移性乳腺癌中高表達的miR-103/-107能夠快速降解NKILA，抵消NF-kB對NKILA的促進作用。大量實驗表明NKILA可結合NF-kB/IkB形成穩定的復合物，并直接遮蓋IkB的磷酸化motif，由此抑制了IKK誘導的IkB磷酸化以及NF-kB激活，形成負反饋。在炎癥條件下，NKILA對于阻止NF-kB信號通路在乳腺細胞中的過度激活起到關鍵作用。同時，大量乳腺癌臨床標本的研究表明，高表達的NKILA與乳腺癌患者的不良預后密切相關。這些研究提供了乳腺癌的潛在治療靶點和預后生物標記物。
原文出處
A Cytoplasmic NF-kB Interacting Long Noncoding RNA Blocks IkB Phosphorylation and Suppresses Breast Cancer Metastasis. Cancer Cell, 2015, 27, 370–381.
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