細胞技術(shù)專題：細胞自噬的研究方法

瀏覽次數(shù)：1249　發(fā)布日期：2014-2-13　來源：上海北諾生物科技有限公司

正常培養(yǎng)的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報道的工具藥有：

一、自噬誘導(dǎo)劑

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

二、自噬抑制劑

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學技術(shù)對自噬相關(guān)基因進行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/DIV>

三、自噬過程進行觀察和檢測

細胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術(shù)有：

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成

自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。

（注意：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。）

4、檢測長壽蛋白的批量降解：非特異

5、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

四、自噬相關(guān)蛋白的定位

在研究自噬相關(guān)蛋白時，需對其進行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。

Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細胞死亡時不會被釋放。