酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗體的重要方法。它是采用抗原與抗體的特異結(jié)合將被測(cè)物質(zhì)與酶標(biāo)抗體進(jìn)行直接或間接結(jié)合，然后通過(guò)標(biāo)記酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)進(jìn)行定性和定量分析。那么，它與其它檢測(cè)方法的靈敏度及您了解嗎？

ELISA通常分為四種類型：直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法等。

直接法（Direct ELISA）僅需要抗原和酶標(biāo)一抗，操作簡(jiǎn)便，可避免交叉反應(yīng)，然而該方法要求酶標(biāo)一抗有較高的特異性要求，同時(shí)也并非所有的一抗適合標(biāo)記處理。直接法在實(shí)際運(yùn)用中并不多見(jiàn)，它并不能對(duì)樣本中抗體進(jìn)行定量分析，因?yàn)闃颖局锌贵w是非酶標(biāo)抗體，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)顯色，但是該法經(jīng)過(guò)改進(jìn)就是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，見(jiàn)后文。

間接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信號(hào)強(qiáng)度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。間接法只能用于測(cè)定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。

夾心法（Sandwich ELISA）分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

雙抗體夾心法中抗原被兩個(gè)抗體——捕捉抗體和檢測(cè)抗體，結(jié)合于不同位點(diǎn)。捕捉抗體固定于載體上，檢測(cè)抗體通過(guò)結(jié)合抗原進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測(cè)的抗體需是單抗，而且對(duì)同一抗原結(jié)合位點(diǎn)不同，如此才能避免交叉反應(yīng)或兩種抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同一位點(diǎn)。夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢(shì)，但該法只適用于有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測(cè)，主要用于檢測(cè)各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中測(cè)定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測(cè)過(guò)程中有時(shí)會(huì)將樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)（一步法），此時(shí)如果樣本中抗原含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而不形成“夾心復(fù)合物”，此時(shí)測(cè)出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果（鉤狀效應(yīng)hook ffect）。因此，如果使用一步法測(cè)定樣本中抗原含量時(shí)要注意測(cè)量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。

雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測(cè)樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進(jìn)行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來(lái)測(cè)定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上測(cè)定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測(cè)時(shí)被測(cè)樣本不需要稀釋即可直接進(jìn)行測(cè)定，故此靈敏度相對(duì)而言高于間接法。

競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive ELISA）是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體（或抗原）濃度越高，則能與固定抗原（或抗體）結(jié)合的酶標(biāo)抗體（或抗原）就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對(duì)照相比，顯色越淺，表示檢測(cè)樣本中抗體（或抗原）含量越高。該法適合比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測(cè)的靈敏度和專一性較差。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體常常用于檢測(cè)某些干擾物質(zhì)不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原常用于檢測(cè)小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測(cè)定。

捕獲包被法也稱為反向間接法，主要用于測(cè)定血清中某類抗體亞型如IgM。為排除血清中IgG的干擾，用抗IgM抗體包被后用于捕捉樣本中的IgM，然后加入特異性結(jié)合抗原進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。捕獲包被法常用于對(duì)病毒性感染的早期診斷。在測(cè)定IgM的實(shí)驗(yàn)中常受到類風(fēng)濕因子（RF，一種能結(jié)合多種動(dòng)物IgG Fc的自身IgM抗體）的干擾，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段制備酶標(biāo)抗體可以消除RF的干擾，這一方法在雙抗體夾心法中也具有同樣的效用。

除了這五種檢測(cè)方法，新興的ELISA檢測(cè)技術(shù)不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)，例如基于細(xì)胞的ELISA（cell-based ELISA），是將細(xì)胞接種于微孔板中取代原來(lái)的抗原，該方法可以對(duì)一些處理造成的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的蛋白含量變化進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需裂解細(xì)胞，可減少目的蛋白的損失，而其缺點(diǎn)即不能對(duì)抗原進(jìn)行定量分析。