研究背景

外周神經系統（PNS）損傷后的修復涉及到非常復雜的生物學功能。殼聚糖作為一種人工神經導管，在治療PNS修復過程中有非常顯著的效果。當然，在這個過程中，殼聚糖的作用不僅僅是作為神經修復的支架，其降解產物殼寡糖（COS）是具有促進組織再生功能的。然而，目前這種現象的具體作用機制還不是很清楚。本研究組之前的研究發現，COS通過miR-27a/FOXO1促進細胞周期，刺激Schwann cells（SCs）增殖而促進神經細胞再生。在本研究中，我們發現新COS通過調控miR-327,刺激SCs細胞分泌趨化因子，進而誘導巨噬細胞創造穩定微環境，使得神經能夠再生。

研究思路  

研究結果

1. COS促進受傷坐骨神經處SC增殖和軸突延伸

       為探究COS對神經修復的作用，我們首先通過大鼠模型，在受傷坐骨神經移植COS和陽性對照NGF及鹽處理對照。12天后的表型分析顯示，COS和NGF組修復都非常好，SCs增殖顯著，NF陽性軸突顯著增加。因此，這部分的建模實驗和處理，非常好地表明了COS對神經修復的作用。

2. COS誘導炎癥因子表達和巨噬細胞招募

       已有的研究發現器官再生時的微環境塑造過程中，炎癥因子扮演著非常重要的作用。因此，我們首先檢測了受傷后不同時間點的炎癥因子表達。結果顯示，TNF-α，IL-6，IL-1β快速升高，表明炎癥細胞可能被招募到受傷區。通過免疫染色，我們發現CD68陽性細胞在4天就達到峰值。因此，這些數據都表明，COS會快速激活炎癥因子表達和巨噬細胞積累。

3. COS依賴于SCs刺激巨噬細胞遷移

       那么，COS招募巨噬細胞的內在機制是什么呢？利用巨噬細胞模型RAW246.7，我們進行了COS處理，發現遷移沒有明顯變化。因此，我們在此基礎上，通過wound-healing實驗，我們把COS處理的RAW246.7與SCs共培養。結果表明，巨噬細胞發生了遷移，且被COS強化，但又不是因為增殖引起。因此，COS依賴于SCs刺激巨噬細胞遷移。

4. COS引起SCs內的miRNA和mRNA變化

       我們前期的測序結果（該研究中RNA測序服務由伯豪生物提供）表明COS處理SCs后，有172個差異miRNA和4399個mRNA表達變化。在這里，我們重點關注了傷口應激，免疫應激，TNF胞內反饋，器官再生和細胞因子調控信號通路。GO和KEGG功能富集顯示，共有51個miRNA和77個mRNA符合以上指標。進一步的miRNA和mRNA網絡構建，我們現在共有兩個大類出現：一個涉及到增殖，包含miR-182,miR-345-5p等；一個涉及到炎癥，包含miR-327,miR-193-3p，miR-20a-5p，CCL2,CCL7等。同時，miR-327,miR-193-3p的潛在靶基因是CCL2, miR-17-5p和 miR-106-5p的潛在靶基因是CCL7。因此，我們把他們作為接下來研究的候選。

5. MiR-327在SCs中降低CCL2的表達

       當SCs處理COS后，miR-327下調，CCL2顯著上調，而miR-193沒有顯著變化。所以，可能是miR-327在SCs中調控了CCL2。因此，我們用熒光素酶報告系統進行了驗證，確實發現miR-327可以結合到miR-327的3’UTR區，抑制其表達。 6. SC中的MiR-327/CCL2調控巨噬細胞遷移
       為確認miR-327/CCL2是否參與巨噬細胞的招募過程，我們進行了transwell 遷移實驗。通過在SCs中siRNA敲降CCL2,我們發現RAW264.7細胞的遷移能力減弱。同樣，miR-327的過表達和敲降實驗也得到了一致的結果。

7. COS調控坐骨神經中的miR-327/CCL2

       以上的功能實驗都是基于細胞，那么，在真實的坐骨神經受傷時，miR-327/CCL2調控通路是否存在的？我們在大鼠COS移植外周神經缺陷模型后，檢測miR-327的表達。結果顯示，術后1天和4天，表達顯著降低，而CCL2顯著增加。因此，SCs中的CCL2在招募巨噬細胞在創口處營造適宜微環境影響神經再生過程中，確實發揮了非常重要的調控作用。

研究結論

       我們的研究通過模型構建和檢測，發現殼聚糖降解物COS在神經修復過程中有重要作用。運用高通量測序和后續實驗驗證，我們闡明了COS通過SC s中的miR-327，調控CCL2的表達，進而影響了巨噬細胞的遷移和招募，最終通過傷口處的微環境重塑而影響外周神經再生的生物學機制。我們的研究為理解殼聚糖降解物在神經修復過程中的作用提供了理論依據。

原文出處：Zhao Y, Wang Y, Gong J, et al. Chitosan degradation products facilitate peripheral nerve regeneration by improvingmacrophage-constructed microenvironments.Biomaterials,2017.