這篇應用文章介紹了如何利用Molecular Devices公司的具有化學發光的微孔板讀板機進行相應檢測，儀器和試劑盒組合簡單易操作，進行相應檢測時表現出很高的靈敏度。兩種類型的檢測試劑盒均可在Molecular Devices公司推出的具有化學發光的微孔板讀板機進行相應的檢測實驗，獲得較優的結果。

優勢

- 靈敏、可靠的支原體檢測方式
- 簡單、易操作、可快速獲得檢測結果
- 檢測結果簡單、明了

簡介

支原體是目前已知最小的原核生物，是一種常見于哺乳動物細胞培養中污染源。支原體污染讓細胞培養人員付出很大代價，因為它們改變了受污染細胞的形態、活力和代謝特征。通過顯微鏡很難在培養基中發現支原體。目前針對這種情況的污染需要一種靈敏可靠的檢測方法，傳統的支原體污染物檢測方法如耗時標記法和繁瑣的PCR等，檢測結果也很難得到準確分析。

MycoAlert支原體檢測試劑盒和MycoAertPLUS檢測試劑盒均來自Lonza Walkersville有限公司，此試劑基于生化反應配合具有發光功能微孔板讀板機來檢測某種支原體酶活力。這些酶的存在提供了一種快速篩選過程，可以非常靈敏的對測試樣品進行支原體污染檢測。MycoAert PLUS作為下一代的檢測試劑盒，較上一代標準版試劑盒具有更高光量子輸出效率，化學發光讀板機獲得更寬的動態學范圍，無論是培養基、細胞培養基上清、水均能進行相應檢測。兩種試劑盒的程序步驟一致。

第一步首先將MycoAlert試劑加入細胞培養上清液中，裂解支原體觸發化學發光反應，如圖一所示；第二步，有活力的支原體被裂解并釋放出能與MycoAlert底物反應的酶，催化ADP 轉化為ATP，通過檢測樣品中加入MycoAlert底物前后ATP的水平，可以得到其比值并指明支原體是否存在。如果這些酶不存在，那么第二次的讀數將不會增加。(MycoAlert的Ratio＜0.9和MycoAert PLUS的Ratio＜1.0)，如果樣品陽性的話，其第二次檢測值高于第一次，Ratio＞1.2，如圖二所示為檢測流程。

材料：

- MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza cat. #LT07-318)
- MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza cat. #LT07-710)
- MycoAlert Assay Control Set(Lonza cat. #LT07-518)
- 96-well polystyrene solid white plates(Greiner cat. #655075)
- 微孔板讀板機
- SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax Paradigm多功能微孔板讀板機
- SpectraMax M5 多功能微孔板讀板機
- FilterMax F5 多功能微孔板讀板機
- SpectraMax L 微孔板讀板機

方法

MycoAlert和MycoAlert PLUS試劑盒基本原理一致，但是其兩種試劑盒檢測濃度動態學范圍不同，詳細信息如下，每種試劑盒在使用當天進行試劑配置。

MycoAlert陽性質控樣品稀釋關系如表一所示，100 μL系列稀釋的MycoAlert陽性質控樣品加于白色96-孔發光多孔板中做3個重復。100 μL MycoAlert試劑(溶于MycoAlert緩沖液中)加于每個孔中并在室溫下孵育5分鐘。孔板置于發光型微孔板讀板機中，使用SoftMax? Pro 軟件(讀數A)的讀取所選孔的讀數。100 μL的MycoAlert底物(溶于MycoAlert緩沖液)立即加入到每個孔中并在室溫下孵育10分鐘�？装逯糜诎l光型微孔板讀板機中進行檢測，所選孔的讀數(讀數 B)。儀器設置見表二。

結果

我們利用Lonzede公司的MycoAlert試劑盒針對所有發光型微孔板讀板機進行靈敏度評價，針對于MycoAlert試劑盒質控樣品在1:8稀釋倍數關系時獲得Ratio＞1.2，而針對于MycoAlertPLUS試劑盒質控樣品在1:1000稀釋倍數關系時可獲得Ratio＞1.2。

所有的MolecularDevices公司推出的發光功能的微孔板讀板機均能獲得超過預期的靈敏度，我們列舉了利用SpectraMaxi3x多功能微孔板讀板機和兩種試劑盒檢測數據值，如圖三所示；而表三顯示所有MolecularDevices的微孔板讀板機對陽性樣品稀釋至最低比率關系也可檢測到Ratio＞1.2的信息情況。

結論

結果顯示所有Molecular Devices公司具有發光功能的微孔板讀板機均能夠滿足此試劑盒的檢測要求，并獲得靈敏的檢測結果；Molecular Devices微孔板讀板機結合MycoAlert試劑盒，能夠靈敏、迅速的檢測支原體含量，確保及時檢測到污染物，節省后期實驗的寶貴時間。