介紹

在遺傳學和分子生物學中，對核酸和蛋白進行定量是許多復雜實驗必要的上游檢測。雖然已有多種檢測方法，但是最常用的仍然是紫外分光光度法。紫外分光光度法的原理是利用分子在固定波長范圍吸收光和散射光，在朗伯比爾定律(方程式1)的基礎上計算待測物質的濃度。這種方法還需要提前知道樣品的摩爾消光系數和通路長度。

A = εcL

方程式1：朗伯比爾定律是指吸光度(A)等于分子摩爾消光系數(ε)乘以濃度(c)和通路長度(L)。變換等式后我們可以利用吸光度來計算濃度。

核酸定量已經是一門非常成熟的檢測技術了，并且與最初相比其檢測原理并未發生太多的改變。我們可以在260nm波長下檢測核酸濃度，并且可以利用230nm和280nm波長檢測樣本純度。

我們同樣可以用紫外分光光度法對蛋白質樣本進行定量，然而除此之外還有更多更準確的比色測定法。紫外分光光度法利用色氨酸的芳香結構特性吸收280nm波長的光，濃度的計算依賴于氨基酸序列上的不同含量的色氨酸殘基。另外，二喹啉甲酸(BCA)蛋白實驗可以在不依賴于氨基酸序列和長度的情況下檢測蛋白濃度。此方法是在堿性條件下利用雙縮脲反應使氨基酸骨架和銅離子形成帶顏色的螯合物進行測定的。

SpectraMax® ABS Plus 是一款理想的進行這些定量實驗的紫外可見光譜微孔讀板機。在這里，我們展示了幾種不同的將ABS Plus reader 和 SpectraDrop^TM MicroVolume Microplate and SoftMax® ProSoftware 相結合用來定量檢測雙鏈 DNA和牛血清白蛋白 ( BSA ) 的方法。

優勢

- 更寬的波長檢測范圍：190 - 1000 nm
- 配合使用超微量板可大大節省樣品的上樣量
- SoftMax Pro 軟件預置模板使得操作更加簡便

材料

- SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機(Molecular Devices cat. #ABS Plus)
- SpectraDrop 超微量板 (Molecular Devices cat. #0200-6262)
- 96 孔平底透明塑料板 (Greiner Bio-Onecat. #655101)
- UltraPure^TM 小牛胸腺 DNA 溶液 (ThermoFisher Scientific cat. #15633019)
- Pierce BCA 蛋白質定量試劑盒 (ThermoFisher Scientific cat. #23225)
- Pierce^TM 牛血清蛋白標準品 Ampules, 2mg/mL (ThermoFisher Scientific cat.#23209)
- UV-Star® 96 孔板 (Greiner Bio-Onecat. #655801)

方法

DNA 定量

1000 ng/μL 的超純小牛胸腺雙鏈 DNA，用1x PBS 倍比稀釋。將 2 或 4 μL 樣品加入 64 孔 SpectraDrop 微量板中，并用0.5 mm 或 1.0 mm 蓋玻片蓋住樣品。打開 SoftMax Pro 軟件中預先設置好的程序“SpectraDrop DNA Quantitation”，按照默認設置對板進行讀數。數據結果用雙對數曲線進行表示，SoftMax Pro 軟件會進一步生成標準曲線。另外，通過范圍為 220 nm 至 350 nm，步進為 4 mm 的光譜掃描可以檢測樣品純度。

我們也比較了運用比色皿和微孔板進行DNA 定量檢測的優劣。待測樣品按照倍比稀釋為 250 ng/μL 至 0.5 ng/μL，然后加入紫外透明 96 孔微孔板中 ( 每孔 200μL )或者紫外可見比色皿中 (1000 μL)。我們用 SpectraMax ABS Plus 微孔讀板機在 260 nm 對樣本進行了檢測。數據結果用雙對數曲線進行表示，SoftMax Pro 軟件會進一步生成標準曲線。

蛋白質定量

按照 BCA 實驗試劑盒提供的步驟稀釋蛋白樣本并做標準曲線。將 25 μL 蛋白標準品和 200 μL BCA 反應液加入 96 孔微孔板中37°C 孵育 30 min。用 SoftMax Pro 軟件打開預設程序“BCA”，在 562 nm 波長條件下讀數。數據用二次方曲線擬合，進而用 SoftMax Pro 軟件生成標準曲線。

結果

ABS Plus 微孔讀板機可以在微量和標準微孔板條件下定量檢測雙鏈 DNA 濃度。利用SpectraDrop 微量板和預設程序，ABS Plus微孔讀板機可以檢測到濃度低至 2 ng/μL體積為 4 μL 的樣本，并且可以同時測量計算相關參數如 A₂₆₀ / A₂₈₀ 和 A₂₆₀ / A₂₃₀ 比例 ( 圖 1 和 圖 2 )。光譜掃描可以進一步檢測樣本是否被污染 ( 圖 3 )。另外，ABSPlus 微孔讀板機可以用微孔板方法對雙鏈DNA 定量。利用紫外區透光型微孔板，讀板機可以檢測濃度低至 0.02 ng/μL 的雙鏈DNA ( 圖 4 )。最后，SpectraMax ABSPlus 微孔讀板機可以在 BCA 濃度測定法的基礎上檢測蛋白濃度。按照試劑盒說明書的步驟檢測 BSA 標準品濃度并繪制標準曲線 ( 圖 5 )。

結論

SpectraMax ABS Plus 微孔讀板機是一款簡單可靠的儀器，支持多種檢測方法，如比色皿和微孔板，進行核酸和蛋白質定量的微孔板檢測儀器。如果和 SpectraDrop超微量板搭配使用，此讀板機可以一次定量 64 個體積低至 2 μL 的樣本。另外，SoftMax Pro 軟件的預設模板程序可以優化實驗條件并且能更快得到結果。