小小身體蘊含大大能量！前列腺癌非侵入性的診斷和監測的新方式——胞外囊泡（外泌體）代謝組學！目前，胞外囊泡/外泌體作為非侵入性的癌生物標志物已成為新的研究熱點。百趣代謝組學文獻分享，芬蘭赫爾辛基大學學者Maija Puhka在期刊 Theranostics（IF=8.85）上發表了相關文章，下面我們一起來看看吧！
 

作者：Maija Puhka  芬蘭 赫爾辛基大學
期刊：Theranostics
影響因子：8.85

1研究背景
胞外囊泡（EVs）是一種很有前景的生物標志物來源。代謝組學文獻分享，近些年來研究的熱點-外泌體就是一種直徑在40-100nm的盤狀囊泡，在許多研究，特別是針對癌癥的研究，都集中在EVs的RNA和蛋白質載體上，其中有一些EVs來源的癌癥生物標志物已經在臨床上使用，除此之外，在脂質、DNA和糖蛋白分析方面也有新的進展。

由于癌細胞會比正常細胞分泌更多的囊泡，因此通過研究體液中EVs代謝物的含量變化可以提供一種檢測癌癥動態相關生物標志物的方法，EVs在前列腺癌和其他癌細胞的代謝控制中起到了重要的作用。代謝組學文獻分享，本文研究了尿液和血小板EVs中的小分子代謝物水平，并采用不同的歸一化方法，分析比較了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康對照組的尿液EVs（UEVs）樣本。

2研究方法
1. 采用靶向超高效液相色譜法質譜聯用技術（UPLC-MS），分析原始尿樣、血小板及其分離的EVs中的一百多種代謝物。
2. 確定了EVs富集的代謝產物后通過數據庫搜索分析其亞細胞來源、途徑和相關酶或轉運蛋白。
3. 比較了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康對照組的尿液EVs（UEVs）樣本，檢測EVs及尿液來源因子及代謝物間比率，以確定組學數據的歸一化分析方法。

3研究結果
1. 對EVs的分離及驗證
采用差速離心的方法對尿液或血小板濃縮物分離得到EVs樣品，并利用EM（電子顯微鏡）、Western blotting（蛋白免疫印跡）和NTA（納米粒子跟蹤分析）對分離得到的EVs樣品進行了驗證，EM觀察到的大多數UEVs具有單個膜的球狀體，同時也發現一些多膜層EVs；WB表明UEVs中無細胞碎片，用NTA測定的單個樣品中，UEVs的尺寸分布變化不明顯。綜上表明：分離得到的EVs樣品中有足夠純度的EVs。
 

圖1.EV樣品的分離驗證

（A. EM顯示UEVs典型的圓形形態和大小范圍；B.偶爾見到多膜層的UEVs；C-D.EVs標志物CD59和CD63的免疫標記顯示；E. EM圖像中UEVs的大小分布表明；F. 經EM觀察，血小板EVs(PEVs)具有典型的形態特征；G.UEVs分離的WB驗證。）
 

圖2. 應用WB法和NTA法對UEVs樣品進行代謝組學表征

（A. 用EVs標記物對UEVs樣本進行Western blotting；B. UEVs濃度的NTA分析；C.UEVs的尺寸分布）

2. 靶向代謝組檢測所需最低EVs量的確定
在檢測過程中發現，對于1×109EVs，大多數代謝物仍低于檢測限，在分析1010EVs時，結果顯示大多數代謝物高于檢測限。在UEVs樣本中，102種代謝物中有40-82種（39-80%）高于檢出限，32-55種（31-54%）高于定量限，在PEVs樣品中，111種代謝物中有62種（56%）被檢出，41種（37%）高于定量限。

3. 尿液、血小板EVs中主要代謝產物類別、途徑及其濃度
EVs中常見的代謝物可以分為五類：1）有機酸及其衍生物，2）核苷酸、糖和衍生物，3）肉堿，4）維生素B/相關代謝物，5）胺。分別分析了所有UEVs或PEVs中被定量的化合物，進行了代謝物富集分析，并使用代謝物摩爾質量除以EVs總體積以計算EVs中代謝物的濃度。代謝組學文獻分享，結果表明：不同來源的EVs代謝譜具有相似性，但是也表現出明顯的差異，EVs中含有能夠富集到多種通路的物質，且其中某些物質具有較高濃度。
 

圖3. UEV和PEV中代謝物含量及途徑的比較

（A.UEVs和PEVs中高于定量限的代謝物韋恩圖分析；B.代謝物富集分析）

4. 尿液、血小板EVs代謝物的重疊及差異
尿液、血小板及其分離EVs中的代謝產物存在重疊，但也存在各自特有的代謝產物。在所有尿液樣本中，83個高于檢測限的代謝物中，有36個（43%）在所有對照UEVs樣本中被檢測到，在所有血小板樣本中檢測到的51種代謝物中，有47種（92%）也在所有PEVs中檢測到。代謝組學文獻分享，結果表明：分離的EVs和對應的來源樣本中的代謝物譜是有重疊的，但在定性和定量上卻有明顯差異，這表明我們成功地純化了EVs，并對其EVs內代謝物進行了分析。
 

圖4. EVs中代謝物含量與其來源的韋恩圖比較

5. EVs中特定代謝物與已報道的EVs中存在的酶和轉運蛋白有較好的相關
確定EVs富含的代謝產物后通過數據庫分析其亞細胞來源。結果表明：EVs豐富了一系列細胞溶質代謝物，其中包括核苷酸和亞精胺途徑的產物，這些產物與許多EVs駐留酶和轉運蛋白相關。
 

圖5. EVs代謝物的亞細胞定位

6. 采用不同的歸一化方法比較前列腺癌中EVs代謝物含量的變化
對前列腺癌患者手術前后及健康人的尿液EVs進行了比較，并利用EVs的體積、數量和CD9光密度對數據進行歸一化，得到了相似的結果。代謝組學文獻分享，結果表明：前列腺癌患者的腺苷、葡萄糖醛酸鹽、異丁酰-L-肉堿和D-核糖5-磷酸含量均低于健康對照組和前列腺切除后尿液樣品的2-26倍（P＜0.05），這些變化僅能在EVs來源的因子或與代謝物的比值中被發現，在原尿樣品中則不存在，與EVs來源因子和代謝物比率歸一化相比，尿量或肌酐歸一化沒有顯著差別，說明對EVs衍生因子的歸一化或代謝物比率的分析最有可能揭示EVs代謝物譜中與癌癥相關的變化。
 

圖6. 前列腺癌中UEVs中代謝物顯著變化

（A.將單個UEVs中代謝物濃度歸一化為CD9的OD值；B. 兩種代謝物之間的比率表明在前列腺切除術前的樣本中代謝物的變化）

4 結論
研究表明：不同來源樣本的EVs代謝物分析可以采用高通量的平臺，而且僅需要相對少量的樣品材料。代謝組學文獻分享，通過代謝物的特異性富集及歸一化方法的應用，利用EVs代謝組學其代謝產物可以通過不分析原始的EVs來源物質，而直接獲得新的生物標志物。EVs代謝組學可以提供一種新的非侵入性和高通量工具，用來監測前列腺癌或其他疾病。