文獻解讀：單細胞分辨率下破骨細胞形成過程
導語
破骨細胞是唯一的骨質吸收細胞，該細胞在骨代謝中有核心作用，同時也和在病理條件觸發的骨質損傷有關。在出生后，造血干細胞來源的前體升高并轉化為破骨細胞，這種轉化需要巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB配體受體激活劑（RANKL）的刺激下產生，而這兩種因子都是由“破骨細胞生成支持細胞”分泌，如成骨細胞和骨細胞1-3。
然而，破骨細胞分化過程機制尚不明確。因此，本文研究了7228個小鼠細胞的轉錄組，結合體外實驗分析破骨細胞的形成過程。基于單細胞轉錄組結果，本文發現破骨細胞前體細胞瞬時表達CD11c，并且在CD11c表達的細胞中敲除RANKL，會阻止這部分細胞進一步形成破骨細胞。同時本文證實反式激活子（Cited2）作為核心分子刺激破骨細胞的末端分化。破骨前體細胞Cited2缺失后會導致破骨細胞分化失敗。總結：本文提供了破骨細胞分化過程詳細的分子路線圖，細化和擴大我們對潛在分子機制的理解。
科學技術
單細胞轉錄組測序；Bulk RNA-seq
實驗思路
研究結果
1. scRNA-seq檢測破骨細胞體外培養系統中的細胞異質性
小鼠骨髓細胞用先用M-CSF培養2d，這些細胞被進一步用M-CSF聯合RANKL培養3d（圖1a）。本文通過單細胞測序，分析質檢通過的7,228個細胞。設計了第0天，第1天和第3天三個分組，分別對應2,190、2,649和2,389的細胞數。基于無監督聚類方法區分了12個cluster，涵蓋以上三個分組（圖1b）。cluster7只出現在第3天且高表達破骨細胞相關的標記基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Nfatc1，Dcstamp，Atp6v0d2）表明cluster7代表成熟的破骨細胞（圖1b，c）。在相比之下，cluster 1在第0天大量存在，但是在第1天和第3天會消失。cluster 1顯示破骨前體細胞的標志物（Tnfrsf11a,，Csf1r和Cx3cr1），同時還有破骨細胞形成的內在負調節因子（Irf8, Bcl6和Mafb；圖1b，d，e），這些都提示cluster1中包含了破骨前體細胞。
2. 破骨細胞分化軌跡
下一步，本文通過Slingshot分析方法進行擬時序分析，該方法基于聚類的12個cluster預測它們的分化軌跡。分析結果表明cluster1經過cluster9，cluster3，cluster2和cluster4逐步轉化cluster7（圖2a）。在這轉化過程中，破骨細胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表達水平逐漸升高，而骨破骨形成負調控因子(Irf8，Bcl6和Mafb)的表達水平逐漸下調（圖2b），結果與bulk RNA-seq 數據一致。
接下來，我們使用Slingshot進行偽時間分析，該方法可以基于基于聚類的最小生成樹12預測分化軌跡。偽時間分析表明，聚類1通過逐步分化為聚類7，并經過聚類9、3、2和4（圖2a）。在這一過程中，破骨細胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表達水平逐漸升高，而與破骨形成負調控因子（Irf8，Bcl6和Mafb）的表達水平逐漸下調（圖2b），該結果與bulk RNA-seq數據結果一致。Itgax（編碼蛋白CD11c）為樹突細胞（dendritic cell，DC）標記基因；而在破骨細胞發生的分化軌跡中，Itgax的表達短暫上調（圖2c）。這也預示著破骨前體細胞表達特征和DC有相似地方。
有一些研究認為DC細胞就是破骨前體細胞；但也有相關研究發現小鼠即便有成熟DC細胞缺陷，也不會對破骨細胞的形成造成影響。為此構建基因工程鼠，特異性抑制DC細胞中Tnfrsf11a的表達（Tnfrsf11aflox/ΔCD11c-Cre），該小鼠和對照小鼠（Tnfrsf11aflox/Δ）相比，破骨細胞的形成明顯受到抑制；與之相反骨組織的體積、骨小梁的厚度增加（圖2d–h）。
為了進一步驗證擬時序的結果，本文進一步探索了培養第1天的細胞表面的標志物（圖2i）。結果顯示C5aR1+CSF1R+細胞（cluster2和cluster3）和C5aR1−CSF1R+細胞（cluster4）轉化為破骨細胞；而C5aR1−CSF1R−細胞（cluster6和cluster8）未能分化為破骨細胞，這表明cluster2、3和4代表了破骨前體細胞，但cluster6和cluster8不具備分化成破骨細胞的潛力（圖2j）。這些結果進一步驗證了破骨細胞分化軌跡，并明確破骨細胞體外培養中展現的細胞異質性（圖2k）。
3. 破骨細胞形成過程中的逐步生物學過程
為了闡明破骨細胞發生的分步生物學過程，本文需cluster1、9、3、2、4和7進行了GO富集分析（圖3）。cluster1代表第0天的破骨前體細胞，主要設計單核細胞轉錄組表達包括：髓系白細胞活化、髓系細胞分化、吞噬體和Fcγ受體依賴的吞噬細胞（圖3）。cluster9代表DC樣前體細胞，富集抗原處理和呈遞相關（圖3）。cluster3可能代表RANKL誘導的早期破骨前體細胞，其中包含了膜筏上產生含有RANK復合體和基于酪氨酸的免疫受體激活信號，這些功能促進破骨細胞信號轉導（圖3）。cluster2主要是破骨前體細胞增殖激活的代謝功能。cluster4主要涉及能量代謝和末端分化。cluster7主要呈現破骨細胞的特征，包括骨質吸收和內吞等功能。
4. Cited2作為觸發破骨細胞末端分化的分子開關的鑒定
本文最后還研究了參與調控破骨細胞生成的轉錄因子。伴隨破骨細胞形成的過程中有25個轉錄調控因子發生了顯著的改變。其中Cited2可以調控一些破骨細胞形成的核心基因，如Nfatc1和Jdp2。Bulk RNA -seq結果顯示，當敲除Cited表達，破骨前體細胞的細胞周期功能上調（圖4b）。構建基因工程鼠，特異性敲除巨噬前體細胞的Cited的表達（Cited2flox/floxTnfrsf11a-Cre）。工程鼠中破骨細胞的形成明顯受到抑制（圖4c，d）。流式細胞儀分析破骨細胞培養體系的細胞，結果顯示Cited2flox/floxTnfrsf11a-Cre在第一天可以產生CSF1R+C5aR1+細胞(即增殖的破骨前體細胞) ，但在第2天未能繼續轉化CSF1R+C5aR1−（圖4e）。最終歸納破骨細胞分化圖，可以看到細胞逐步改變的狀態并伴隨的調整的功能和通路，Cited2的作用位置，同時還列出每個cluster的高表達基因（圖4f）。
參考文獻：
sukasaki M, Huynh NC, Okamoto K, et al. Stepwise cell fate decision pathways during osteoclastogenesis at single-cell resolution. Nat Metab. 2020;2(12):1382-1390. doi:10.1038/s42255-020-00318-y
