研究結(jié)果
1. 皮膚細胞的單細胞表達譜
本研究對未經(jīng)治療的4例AD患者和5例HC健康人的前肘窩處進行抽吸起泡處理，對吸出皰液的上清進行蛋白質(zhì)組多重分析，并將皰液和酶消化的皰頂(即表皮)的細胞進行混合，用于流式細胞分選（CD45+/CD45-）和scRNA 測序。另外對4例AD患者和2例HC健康樣本的皮膚進行活檢，對活檢后的樣本流式分選（CD45+/CD45-）后進行scRNA-seq，用作對照（圖1A）。對過濾后的抽吸起泡和活檢的細胞，進行聚類以及通過marker基因定義，共鑒定出24（C0-C23）種不同的細胞類型（圖1 B-S）。
 

圖1

2. 比較抽吸起泡和活檢分離的細胞類型圖譜
通過比較AD皮膚活檢(圖2 A-B)與AD和HC抽吸起泡樣本(圖2 C-F)獲得的細胞，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞群在3組中都存在。另外活檢組織中鑒定的4個T細胞和5個DC簇也存在于抽吸起泡樣本(圖2C-D)中，而HCs (圖2E-F)中增殖T細胞( Tcell-3 )、DC-1至DC-3和pDC群的頻率較低，與AD的炎癥本質(zhì)一致，具有較高的免疫細胞數(shù)量。
 

圖2

3. 活檢與抽吸起泡樣本中基因表達的差異
接下來，研究比較了活檢和抽吸起泡樣本的HC組和AD組的差異基因。總體而言，無論是HC抽皰和HC活檢，還是AD抽皰和AD活檢，大多數(shù)基因在抽皰和活檢樣本中表現(xiàn)出相似的表達（圖3A）。但是結(jié)構(gòu)角蛋白在AD和HC樣本中顯示出相似的表達，而炎癥角蛋白（KRT16/KRT6A）在HC樣本(圖3B-C)中顯示出相當弱的表達，這與在非炎癥環(huán)境中炎癥相關介質(zhì)的表達一致。在AD慢性病變中經(jīng)典上調(diào)的其他炎癥標志物中，如TH1相關的( IFNG ) (圖3E)、TH2相關的( IL4R、IL5、IL13)(圖3F-H)和TH22相關的標志物( IL22 ) (圖3J)，在AD樣本中的表達強于HC樣本，這與之前的研究一致。相比之下，TH17激活的標記物（IL17A）（圖3I）和CCL20在抽吸起泡AD中明顯低于活檢樣本。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，在抽皰樣本中可以捕捉到AD典型的TH2 / TH22相關炎癥細胞因子表達情況。
 

圖3

4. 抽吸起泡樣本中AD與HC差異基因比較
為了進一步揭示抽吸起泡樣本中AD和HC樣本之間的基因表達差異，研究在熱圖中展示了10個上調(diào)基因和下調(diào)基因。上調(diào)的基因包括前面提到的TH亞群相關細胞因子IL13和IL22，它們在T細胞中具有相當異質(zhì)性的表達(圖4A，橙色框)，也包括CD4和CD8A在亞群中的表達（圖4B,C）。AD在T cell-2中GZMB和NKG7表達增加，在TREG中IL2RA和TNFRSF4表達增加(圖4B-C)。除KC (KC-5, KC-6)外，TCELL-3簇中增殖標志物高表達，AD比HC中表達水平有升高趨勢。AD和HC中的T細胞均為組織常駐記憶標記CD69陽性(圖4D)，如前所述，調(diào)節(jié)性T細胞水平最低。在DC和巨噬細胞中，一些炎癥標志物如RNASE1、LYZ和CCL17(圖4A，綠框，E-G)在AD中強烈上調(diào)，以及EGFR配體雙調(diào)節(jié)蛋白(AREG)(圖4H)，促進KC增殖。除DC外，AD中KCs(圖4A，藍框)和T細胞中AREG也增加。
 

圖4

5. AD樣本中的T細胞類型
接下來對T細胞進行了亞群聚類并進行了分組間的比較，T細胞被分為了9個亞群，但并不是所有的細胞都表達CD3D（圖5A-B）。其中簇(0、2、3和4)的標記基因分別對應于T cell-1、TREG、T cell-2和T cell-3。其中C1代表靜態(tài)記憶T細胞，C0包含激活的記憶T細胞，其效應功能由促炎細胞因子的活躍產(chǎn)生介導，如TH2和Th22相關的介質(zhì)IL13和IL22，以及Th17相關的細胞因子IL26(圖5C-E)，盡管IL17表達低到缺失。細胞毒性CD8+T細胞主要存在于表達IFNG(圖5F)和GZMB的C3中。
 

圖5

6. 蛋白質(zhì)組學水皰液分析補充了單細胞轉(zhuǎn)錄組學，揭示了多個DC相關標記物的上調(diào)
本研究對8名AD患者和8名HC患者(包括接受scRNA-seq的患者)的皰液進行了蛋白質(zhì)組學分析，補充了細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)。研究使用炎癥、免疫和神經(jīng)學panel進行了Olink多重檢測，其中包含368個已建立的探索性生物標志物。圖6A展示了8例AD和8例HC樣本中olink檢測蛋白的歸一化表達，大多數(shù)AD樣本表現(xiàn)出一些表達水平的增加，但在樣本之間存在相當大的異質(zhì)性。在AD和HC樣品中，有42種蛋白存在顯著差異(FDR<0.05)(圖6B)。為了將檢測到的皰液蛋白質(zhì)分配到特定的細胞類型，繪制了Olink皰液scRNA檢測中與蛋白質(zhì)豐度差異相對應的基因熱圖。該分析顯示了27個標記物，如圖6C所示，大多數(shù)標記物在由DC和巨噬細胞組成的髓系細胞室中發(fā)現(xiàn)。這些基因包括表皮增生介質(zhì)(AREG, EREG)，病原體模式識別受體(CLEC7A)，細胞因子受體(CSF2RA)，與TH2免疫相關的細胞因子(CCL13)，參與組織重塑和細胞外基質(zhì)降解的標記(CDH3, PLAU)，以及在成熟DC上特別表達的共刺激分子(CD40, TNFRSF9) (DC-3)。其他類型的細胞僅表現(xiàn)出某些介質(zhì)的微弱或部分上調(diào)，包括黑色素細胞的CXCL1，一些T細胞的TNFSF11，以及一些KCs的IL18和CXADR（圖6D-L）。
 

圖6

結(jié)論
這些數(shù)據(jù)表明，通過使用scRNA-seq技術，抽吸起泡比傳統(tǒng)活檢具有幾個優(yōu)勢，包括更好的皮膚細胞轉(zhuǎn)錄組分辨率，結(jié)合間質(zhì)液的蛋白質(zhì)組學信息，揭示塑造AD細胞和蛋白質(zhì)組學微環(huán)境的新型炎癥因子。

參考文獻：
Rojahn T B, Vorstandlechner V, Krausgruber T, et al. Single-cell transcriptomics combined with interstitial fluid proteomics defines cell type–specific immune regulation in atopic dermatitis[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020, 146(5): 1056-1069.