精原干細胞移植（Spermatogonial stem cell transplantation，SSCT）被提議作為兒童癌癥幸存者的生育療法。SSCT首先冷凍保存睪丸活檢，然后再進行性腺毒性治療（如癌癥治療）。當兒童癌癥幸存者成年并想要親生孩子時，可以將活檢組織解凍并在體外增殖精原干細胞（SSC），隨后將其自動移植回睪丸。然而，長期增殖過程中的培養應激可能會導致SSC的表觀遺傳學變化，如DNA甲基化變化，并可能遺傳給SSCT后出生的子代。因此，在臨床實施這種新型細胞療法之前，SSCT需要對衍生子代進行詳細的臨床前表觀遺傳學評估。
 
2023年04月07日，荷蘭阿姆斯特丹大學UMC生殖醫學中心生殖生物學實驗室Callista L Mulder團隊在《Clin Epigenetics》雜志發表了題為“Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells”的研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）在多代小鼠模型中研究了SSCT衍生子代具有體外增殖SSC精子的DNA甲基化狀態。
標題：Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells在長期培養的精原干細胞移植后出生的小鼠后代中，精子DNA甲基化水平穩定
時間：2023.04.07
期刊：Clinical Epigenetics
影響因子：IF 7.259
技術平臺：RRBS、BSP、RT-qPCR等
樣本實驗：

研究設計：SSCT子代的多代小鼠模型

F0：移植小鼠，F1：SSCT后出生的第一代，F2：SSCT后親本出生的第二代，F2/M：F2由母系產生，F2/P：F2由父系產生。從代際子代的5只雄性小鼠采集附睪精子，比較DNA甲基化狀態（F0的n=3，F1和F2的每個子代亞組n=5）

研究結果：
通過對第一代和第二代SSCT出生小鼠子代的精子進行RRBS DNA甲基化測序分析，以此來評估SSCT衍生子代的分子表觀遺傳穩定性，并將其與對照組精子進行比較分析。研究結果表明，在所有子代中，DNA甲基化差異比例占總CpG和甲基化區域不到0.5%。所有樣品的無監督聚類分析沒有顯示出基于甲基化差異模式的明顯分組。對與對照組相比在多代SSCT子代中顯著變化的少數單個基因用定量亞硫酸鹽Sanger測序（BSP）和RT-qPCR在不同器官中進行了驗證。僅Tal2的差異甲基化得到證實，與對照F1相比，Tal2在SSCT子代的精子中低甲基化，且在SSCT F1子代的卵巢中表現出更高的基因表達。表明在F1代和F2代精子中，SSCT衍生的子代和對照組之間的DNA甲基化沒有顯著差異。
 
研究圖表：
圖1：所有樣品平均甲基化的無監督聚類熱圖。
所有樣本的熱圖聚類基于每個樣本之間的顯著差異甲基化（F0 n=3在，F1和F2 子代亞組n=5）和所有樣品的平均甲基化（duplo），熱圖中包括前500個變化最大的DMR（高甲基化和低甲基化）的中淺灰色的最后2行

表1：對照組F0/對照組F1與SSCT組/SSCT亞組之間顯著差異的所有DMC和DMR

圖2：與對照組F1相比，SSCT F1和SSCT F2的CpG位點的差異分析（DMC）。

1. 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間CpG甲基化模式變化的CpG數量，顯著高于或低于25%差異截止值并考慮了q值閾值為0.01。x軸和y軸上的值分別是校正后p值的甲基化差異百分比和-log10。
2. 代際間的差異甲基化CpG（DMC）在DNA區域外顯子、內含子、啟動子和基因間區域的分布。

 圖3：與對照F1相比，SSCT F1和SSCT F2子代的DMR差異分析。

1. 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間甲基化模式改變的DMR數量。
2. DNA區域外顯子、內含子、啟動子和基因間區域的差異甲基化區域（DMR）分布。

表2：在SSCT F0、SSCT F1和SSCT F2代際之間的外顯子和啟動子區域中共有的DMR變化基因（粗體字體），這些基因將進一步驗證


圖4：對單個精子樣本的Tal2基因的RRBS結果進行BSP驗證。整體CpG平均值如下：對照F1 24.7%±4.4%、SSCT F1 17.4%±4.5%、SSCT F2/M 22.7%±9.3%、SSCT F2/P 14.5%±3.2%表現出SSCT和對照之間甲基化差異最大（10%）。


圖5：RT-qPCR比較Tal2基因表達分析
F1、F2/M和F2/P中對照組F1和SSCT子代之間的睪丸（A）、卵巢（B）和腎（C）的平均表達率。條形圖和ANOVA的統計分析以及Tukey事后檢驗代表了代際組之間的RNA表達，（每個器官n=5，F1和F2中的每個子代亞組，在技術三倍體中進行RT-PCR）*兩組間觀察到統計學顯著差異（p < 0.05)。


參考文獻：
Serrano JB, Tabeling NC, de Winter-Korver CM, van Daalen SKM, van Pelt AMM, Mulder CL. Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells. Clin Epigenetics. 2023 Apr 7;15(1):58.