封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA試劑盒其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的目的是避免高背景和非特異性條帶。

封閉的原理：

1、固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。

2、蛋白塞進(jìn)了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號。

3、封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛?ldquo;填補(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。這4、樣抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。

封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。

在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，通常使用封閉劑來減少非特異性結(jié)合。常用的封閉劑有脫脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段單鏈二抗等。根據(jù)不同的平臺(tái)選擇相應(yīng)的封閉劑。

1、脫脂奶粉

作用原理：脫脂奶粉含有多種蛋白，可以封閉未吸附蛋白的固相載體（WB 膜、ELISA 板等）位點(diǎn)，減少抗體與之結(jié)合的概率，避免非特異性結(jié)合帶來的高背景。

優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜，因含多種不同分子量的蛋白，故封閉起來更全面。

缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，適用范圍窄。不適用于生物素和堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的生產(chǎn)中較少應(yīng)用。

2、牛血清白蛋白BSA

作用原理：同脫脂奶粉，封閉未吸附蛋白的固相載體位點(diǎn)。

優(yōu)點(diǎn)：成分單一，適用于 ELISA 實(shí)驗(yàn)，生物素、堿性磷酸酶系統(tǒng)的免疫學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)或者其他對特異性要求較高的實(shí)驗(yàn)。

缺點(diǎn)：大部分 BSA 中有少量的抗體殘留，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，造成一定背景。

3、動(dòng)物血清

作用原理：

1、待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，血清和 BSA 沒有明顯區(qū)別；

2、待檢樣本中可能會(huì)有 Fc 受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，而封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本 Fc 受體之間結(jié)合。BSA 則無法封閉 Fc 受體。

優(yōu)點(diǎn)：因?yàn)檠蹇梢苑忾] Fc 受體及減少抗體間的非特異性結(jié)合，故在免疫組化、免疫熒光實(shí)驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用。

缺點(diǎn)：某些封閉血清中可能含有疊氮鈉，因此不適用于 HRP 酶標(biāo)的檢測體系。

4、Fab 片段單鏈二抗

作用原理：由于二價(jià)的抗體（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，不能用來封閉。而 Fab 片段單鏈二抗只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此可完全封閉免疫球蛋白。

應(yīng)用：在 IHC 或 IF 雙標(biāo)/多標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，封閉樣本表面的免疫球蛋白，封閉組織切片或細(xì)胞表面的內(nèi)源性免疫球蛋白，并可解決兩個(gè)一抗來自同一種屬的麻煩。

5、無蛋白封閉劑---新型高效封閉劑

Blocker 無蛋白封閉劑，該封閉劑是通過化學(xué)合成高親水性化合物，不存在生物封閉劑所擔(dān)心的生物安全性、質(zhì)量、批間差等問題。

主要特點(diǎn)：

1）與微球表面活化的羧基偶聯(lián)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵
2）純化學(xué)合成，批間差小，純度高
3）空間結(jié)構(gòu)簡單，更充分的封閉微球表面，降低微球非特異性吸附，減少基質(zhì)干擾
4）提高試劑靈敏度
5）含大量親水基團(tuán)，有利于提高試劑穩(wěn)定性

應(yīng)用領(lǐng)域：乳膠免疫比濁試劑/ 化學(xué)發(fā)光試劑 ，代替 BSA 作為封閉劑或與 BSA 聯(lián)合封閉。

6、免疫試劑穩(wěn)定液

免疫試劑穩(wěn)定液主要用于免疫分析檢測試劑/抗原/抗體/蛋白的保存.  該產(chǎn)品屬于即用型，無需稀釋，使用簡單方便，將待保存物質(zhì)溶于穩(wěn)定液中后置于冰箱即可。免疫試劑穩(wěn)定   液有利于維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)，保持蛋白的生物活性，可延長免疫分析試劑及蛋白的使用期限，確保產(chǎn)品的性能。

應(yīng)用領(lǐng)域:

1）免疫分析試劑保存, 如免疫比濁檢測試劑/化學(xué)發(fā)光檢測試劑
2）蛋白質(zhì)保存，如抗原/抗體/酶類等