01.技術簡述
細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生物體的體液中（如血漿、尿液、腦脊液等）自由存在的、非細胞內的DNA片段。這些DNA片段通常來源于細胞凋亡（程序性死亡）或壞死（細胞損傷或死亡后釋放），可以被釋放到循環系統中，并在體液中被檢測到。cfDNA研究和應用是精準醫療和液體活檢領域的重要方向之一。
 

02.技術優勢

腦脊液樣本：通常作為中樞神經系統疾病研究的樣本選擇。

尿液樣本：常用于泌尿系統癌癥如膀胱癌、腎癌等腫瘤標志物研究及移植排異監測等cfDNA 研究。

血漿樣本要求
樣本采集：靜脈抽血5-10ml，收集到EDTA 抗凝血管中，上下顛倒抗凝采血管，輕輕混勻，全血2-8℃保存不超過4h；如用Streck 采血管收集全血，則5-8℃保存不超過72h。

分離血漿：采血后建議馬上分離血漿，提取cfDNA，-20℃保存；如不能馬上提取，常規采血管采血后必須4h 內（最好30min-1h 內）完成血漿分離，-80℃保存。

樣本運輸：大體積干冰運輸。

04.研究案例
案例1：ctDNA全基因組亞硫酸鹽測序分析，用于癌癥檢測和分子分類
發表期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：8.554/1區
方法：ctDNA-WGBS

此研究納入三組乳腺癌（BC）患者（BC組n=123；健康對照組n=40），利用ctDNA-WGBS技術檢測從200μL血漿中獲得的微量ctDNA（輸入量約1ng）進行測序分析。研究結果發現，在多中心患者隊列中，在早期和晚期BC階段中對于15個ctDNA甲基化標志物的診斷特征表現出高準確性。同時可以在不同的癌癥類型（包括肝細胞癌和肺癌）中可以很好區分雌激素受體狀態的ctDNA甲基化特征。
 

圖：ctDNA甲基化可以作為乳腺癌亞型分類和預測ER狀態的潛在生物標志物[3]

案例2：MeDIP-seq結合機器學習方法，為多癌種生物標志物檢測提供新思路
期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7 / 1區
技術平臺：cfMeDIP-seq等
此研究通過結合cfMeDIP-seq技術和機器學習，分析了215例樣本的cfDNA甲基化組，包括患有肝癌或腦癌的個體樣本（實驗組）以及無癌癥個體樣本（對照組）。利用DMRs、DhMRs或DMRs+DhMRs訓練機器學習模型，結果發現DMRs+DhMRs聯合模型在區分對照組、肝癌和腦癌方面表現出更優性能，研究支持同時利用DMRs和DhMRs進行多癌種檢測的潛力。
 

圖：用于分析血漿cfDNA甲基化的單鏈cfDNA甲基化DNA免疫沉淀測序方法[4]

案例3：ACE-seq無需亞硫酸鹽轉化精準區分甲基化和羥甲基化標記
此研究建立一種利用DNA脫氨酶（APOBEC3A）實現的非破壞性的、低起始DNA量的鑒定5hmC技術（ACE-seq）。與傳統亞硫酸鹽測序（BS-Seq）不同，ACE-seq不依賴于亞硫酸鹽處理，而是通過酶促脫氨反應來區分未修飾的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5mC），同時保護5hmC不被轉化為尿嘧啶。這種方法允許對cfDNA中的5hmC進行精確的定位和定量分析。
 

圖：幾類基因組元件的 5hmC（藍色）和 5mC（紅色）的修飾水平[2]

案例4：cfhMeDIP-seq對5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）特征進行檢測以預測早期胰腺癌
此研究利用cfDNA hMeDIP-seq對胰腺導管腺癌（PDAC）隊列（n=64）與非癌癥隊列（n=243）的5hmC變化進行比較分析。在數千個基因中鑒定差異性羥甲基化，結果表明胰腺發育或功能相關基因和癌癥發病機制相關基因差異最為顯著。在PDAC隊列的cfDNA羥甲基化組中，與KRAS激活和TP53失活在PDAC腫瘤中常見基因調控失調相關的基因表現出差異性富集，表明5hmC變化在早期疾病階段能實現PDAC分類。
 

圖：與非癌癥患者cfDNA相比，PDAC cfDNA中的5hmC占位差異分析[5]

案例5：cfChIP-seq利用cfDNA片段分析組蛋白修飾，揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小有關
此研究利用cfChIP-seq檢測技術從18個健康對照樣本中獲得H3K27ac信號，并結合配對樣本分析循環核小體的cfDNA片段大小模式和H3K27ac信號之間的相關性。隨后構建線性回歸模型，可根據cfDNA片段大小模式推斷血漿中H3K27ac水平（H3K27ac相關信號）。分析發現H3K27ac相關信號與cfChIP-seq測定的H3K27ac相關信號一致。
 

圖：cfChIP-seq揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小之間的關系[7]

案例6：cfDNA低覆蓋度WGS揭示腫瘤患者的全基因組突變特征
此研究對215名患者和227名健康人群的血漿進行全基因組測序（WGS），鑒定出病理性和生理性突變特征。
 

圖：多種癌癥類型的血漿基因突變特征檢測[6]

05.參考文獻
① Shen SY, Burgener JM, Bratman SV, De Carvalho DD. Preparation of cfMeDIP-seq libraries for methylome profiling of plasma cell-free DNA. Nat Protoc. 2019 Oct;14(10):2749-2780. pii: 10.1038/s41596-019-0202-2. doi: 10.1038/s41596-019-0202-2. PubMed PMID: 31471598.

② Schutsky EK, et al.Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat Biotechnol. 2018 Oct 8. pii: nbt.4204. doi: 10.1038/nbt.4204. PubMed PMID: 30295673.

③ Gao Y, et al. Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e1014. doi: 10.1002/ctm2.1014. PubMed PMID: 35998020.

④ Hua X, et al. Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA. Nat Commun. 2024 Jul 20;15(1):6113. pii: 10.1038/s41467-024-50471-1. doi: 10.1038/s41467-024-50471-1. PubMed PMID: 39030196.

⑤ Guler GD,et al. Detection of early stage pancreatic cancer using 5-hydroxymethylcytosine signatures in circulating cell free DNA. Nat Commun. 2020 Oct 19;11(1):5270. pii: 10.1038/s41467-020-18965-w. doi: 10.1038/s41467-020-18965-w. PubMed PMID: 33077732.

⑥ Wan JCM, et al. Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA. Nat Commun. 2022 Aug 23;13(1):4953. pii: 10.1038/s41467-022-32598-1. doi: 10.1038/s41467-022-32598-1. PubMed PMID: 35999207.

⑦ Bai J, et al. Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct 15;121(42):e2404058121. doi: 10.1073/pnas.2404058121. PubMed PMID: 39382996.