文章原創為：FACSelite 文章來源于：流式通

一般免疫亞群分析
General Immune Subset Profiling

流式細胞術常用于監測治療或疾病進程對外周血細胞亞群和蛋白表達的影響，即免疫監測。該技術涉及表面蛋白標記，以評估成熟細胞亞群。更深入的分析可結合細胞因子和轉錄因子。對于高參數檢測，推薦參考Cytometry Part B發布的OMIPs方案。

01.骨干標記
Backbone Markers

全血的一般骨干標記包括：

• CD34：造血干細胞和祖細胞
• CD45：泛造血系標記
• CD15或CD66b：PMN-MDSC，中性粒細胞，嗜酸性粒細胞
• CD14或CD33/CD11c：單核細胞
• CD19：B細胞
• CD56：NK和NKT細胞
• CD3：T細胞
• CD127：ILC
• CD123：漿細胞樣樹突狀細胞和嗜堿性粒細胞
• TCRV α7.2：MAIT細胞
• CD117：肥大細胞

包含CD34的目的是為了從分析中排除祖細胞，如果應用是白血病或其他血液相關惡性腫瘤，這可能非常重要，因為這些疾病是由淋巴母細胞的異常分裂引起的。同樣，如果通過Ficoll分離去除了像中性粒細胞和嗜酸性粒細胞這樣的多形核細胞，可能不需要CD66b或CD15。對于單核細胞的標記表型，另一種替代組合是使用CD33或CD64，而不是或除了CD14。

02.T淋巴細胞
T Lymphocytes

T淋巴細胞分類概覽：

T淋巴細胞的分類基于CD3陽性，并排除CD34、CD19和CD14。為了區分特定的T細胞亞群，需要檢測以下標記：

• γδ T細胞：γδTCR
• MAIT細胞：TCRV α7.2
• NKT細胞：TCRVα24-Jα18

CD56用于排除NKT和NK細胞，但需注意其在MAIT和γδT細胞上可能呈陽性或陰性。在分析時，應先對γδTCR、TCRV α7.2和TCRVα24-Jα18進行門控，再對CD56進行門控，以確保αβ T細胞的純凈度。

T細胞亞群的進一步分類：

CD4和CD8定義了T細胞的單陽性和雙陽性亞群，并通過以下標記的表達進一步區分為幼稚、效應或記憶狀態：

• CD197
• CD45RA
• CD27
• CD28

CD4+輔助性（Th）和CD8+細胞毒性（CTL或Tc）T細胞亞群通過以下組合來識別：

• CCR10
• CD183/CXCR3
• CD185/CXCR5
• CD194/CCR4
• CD196/CCR6

這些表面標記最好與細胞內細胞因子或核轉錄因子的功能標記相結合，以增強分析的準確性。

特殊T細胞亞群：

T輔助濾泡（Tfh）細胞主要位于B細胞濾泡中心，由CXCR5+定義。濾泡調節性T（Tfr）細胞在表達CXCR5+方面與Tfh相似，但功能不同，主要調節B細胞的抗體反應。調節性T細胞（Treg）通常由CD25+/CD127lo/-定義，而Tfr細胞CD25/CD127的表達類似于Tregs。這些亞群的功能表型需要細胞因子或轉錄因子標記來進一步確認。先天淋巴細胞可能表達與T輔助和細胞毒性T細胞亞群相似的細胞因子和轉錄因子譜。

03.自然殺傷細胞亞群標記
Natural Killer Subset Markers

自然殺傷（NK）細胞與NKT細胞的區別在于NK細胞不表達CD3，而CD94+有助于確認NK細胞的身份。NK細胞的進一步分類為成熟NK（NK1）、終末NK（NK2）和早期NK（NK3）依賴于CD56 (bright vs dim)、CD127、CD16和CD57的表達水平和模式。由于某些先天淋巴細胞也可能表達CD56，因此區分CD3-/CD127+的先天淋巴細胞（ILC）和CD3-/CD127lo/-的NK細胞是必要的。

04.單核細胞
Monocytes

單核細胞和巨噬細胞概述：

- 單核細胞和巨噬細胞是免疫系統的關鍵組成部分，具有適應性和先天性免疫功能，主要負責清除微生物、腫瘤細胞和死亡細胞碎片。

- 單核細胞循環于血液中，而巨噬細胞主要駐留于組織中。

- 監測巨噬細胞時，可使用CD80（M1型）和CD206（M2型）標記。

單核細胞分類：

- 單核細胞約占白細胞的10%，通過CD3-/CD14+/CD11c+標記定義。

- 根據CD16和HLA-DR的表達水平，單核細胞分為三類：

• 經典型：(CD14 hi/CD16-/HLA-DR lo/CD11c lo)
• 中間型：(CD14 hi/CD16+/hi/ HLA-DR hi/ CD11c hi)
• 非經典型：(CD14 low/CD16 hi/ HLA-DR+/ CD11c hi)

- HLA-DR的檢測有助于排除髓系來源的MSDC（Mo-MDSC），這些細胞表達CD3-/CD14+/CD16+/-HLA-DR-。

單核細胞功能：
- 經典型單核細胞占外周血中單核細胞的80-90%，具有抗微生物和促炎功能，能分泌活性氧和IL-10，并可分化為Mo-MDSC。
- 中間型單核細胞主要負責抗原呈遞和凋亡調節。
- 非經典型單核細胞參與抗病毒反應和Fc受體介導的吞噬作用，通過CX3CR1在血管中巡邏并招募MHC II+細胞。
- 激活后，中間型和非經典型單核細胞分泌炎癥細胞因子，如IL-6、TNF-alpha和IL-1 beta。
- 經典型和中間型單核細胞在功能上協同作用，受CCR2和CCR5指導侵入組織，分化為巨噬細胞或樹突狀細胞，并表達MHCII以激活T細胞。

05.B細胞
B cells

B淋巴細胞概述：
- B淋巴細胞是適應性免疫系統的關鍵成員，通過CD45+/CD3-/CD19+的標記來識別。
- CD19比CD20更受青睞，因為它是B細胞祖細胞上首先表達的特異性標記，而CD20在抗體分泌細胞（如漿細胞和漿細胞前體細胞）上會丟失。
- B細胞高度異質化，需要產生多樣化的抗原受體（BCR）以及記憶、天真和效應亞群。
- 類別轉換是激活的B細胞改變其重鏈類型（從IgM和IgD到IgG、IgE或IgA）的過程，以優化對特定病原體的體液免疫反應，不影響抗體的特異性，只影響其效應功能。
- B細胞和T細胞受體的特異性在V(D)J重組過程中確定。

B細胞亞群的識別：
- 在B細胞特異性方案中，常用CD20、CD10、CD5、CD27、CD38、IgD、IgM、CD24的組合。
- 在一般免疫分析中，通過CD10、CD27和IgD的組合來區分記憶B細胞亞群。

B細胞標記的表達：
- CD27在約40%的外周B細胞中表達，是B細胞具有抗原特異性記憶和產生免疫球蛋白能力的標記，其在漿細胞抗體分泌細胞（ASC）上的表達增加。
- 存在一個CD27-的B記憶細胞亞群，稱為雙陰性（DN）細胞，其功能仍在研究中。
- CD10是指示淋巴細胞和NK細胞命運祖細胞分化程度和譜系承諾的標記。
- 在B細胞發育中，IgM首先在骨髓中的Pre-B II祖細胞上表達，而B細胞在離開骨髓成為過渡B細胞后才表達細胞表面IgD。

06.粒細胞
Granulocytes

粒細胞是白細胞的一種，以其多葉核（多形核）、體積大（高前向散射FSC）和含有的蛋白質及酶顆粒（高側向散射SSC）為特征。粒細胞包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。在流式細胞術中，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞和嗜酸性粒細胞有顯著差異。

嗜堿性粒細胞：

• 嗜堿性粒細胞的散射特征較低，可能與單核細胞相似。
• 它們表達CD15或CD66b的水平低或不表達。
• 嗜堿性粒細胞的基本標記表型為CD45 lo/ CD3-/ CD14-/ CD66b-/CD123 hi。
• 嗜堿性粒細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）會落入同一群體，因此CD303+和HLA-DR+用于進一步定義pDC，而FcεR1a+用于定義嗜堿性粒細胞。
• 嗜堿性粒細胞占所有白細胞的1%，它們吞噬外來微生物，通過釋放組胺調節過敏反應，通過釋放肝素調節血液凝固。

中性粒細胞和嗜酸性粒細胞：

• 這兩種細胞表達CD15和CD66b。
• PMN-MDSC也表達CD15+/CD66b+，因此CD117+/Lox-1-可以識別中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，而CD177-/Lox-1+可以識別PMN-MDSC。
• 中性粒細胞和嗜酸性粒細胞可以通過CD16和CD193的表達差異來區分。
• 中性粒細胞是感染的第一反應者，通過吞噬作用和吞噬體中的酶降解來破壞病原體。

嗜酸性粒細胞：

• 嗜酸性粒細胞占白細胞的1-5%，具有雙葉核。
• 它們主要在血液循環或身體的脂肪組織中，保護身體免受寄生蟲感染。
• 嗜酸性粒細胞遷移到炎癥部位，并在寄生蟲感染時釋放含有麥芽糖結合蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性粒細胞衍生神經毒素（EDN）和促紅細胞生成素（EPO）的顆粒。
• 這些細胞毒性蛋白混合物可以對感染周圍的組織造成重大損害。
• 嗜酸性粒細胞可以通過CD193+來確認。

肥大細胞：

• 與嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞一樣，肥大細胞（MC）也對FcεRIa陽性，這是一種結合單體IgE的表面受體。
• 骨干標記中包含CD117有助于通過其CD123-/ CD117 hi來表型肥大細胞，與其他CD3-/CD14-亞群相比較。

總結
Conclusion

流式細胞術中的免疫監測或免疫分析主要用于監測人類外周血中細胞亞群和蛋白表達的變化，涉及多種免疫細胞的表面標記，包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和粒細胞等，以評估疾病進程或治療效果。