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定量方法知多少-絕對定量

瀏覽次數:2038 發布日期:2020-10-12  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

在做qPCR實驗時,我們經常會問:“你是做絕對定量還是相對定量呢?”,而定量方法的選擇是取決于實驗的目標。絕對定量可測定目標核酸分子的實際拷貝數,但也是最費力、最復雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準確的標準曲線,常用于確定病毒滴度。

使用標準曲線進行絕對定量

絕對定量是通過樣品的Cq值和標準曲線進行比較實現的。首先為了建立標準曲線,需要已知拷貝數濃度的標準品,對標準品進行5次以上的連續梯度稀釋,將稀釋的標準品進行實時熒光定量PCR擴增,最后根據各樣品的拷貝數濃度及相應的Cq值繪制標準曲線,得到線性方程Cq= -klgX0+b,其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標準曲線進行比較,確定其拷貝數濃度。

從圖1可以發現,當模板起始濃度越大時,熒光達到閾值的循環數越少,即Cq值越小。反之,模板起始濃度越小時,Cq值越大。起始模板量的Log值與循環數Cq值呈線性關系,通過已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線,即可確定未知待測樣本中目的基因的量。

如何選擇標準品?

如前所述,生成絕對標準曲線采用的模板將決定數據的準確度。所以最好使用與實驗樣本盡可能類似的目標模板,可優選有證的標準物質或參考物質。那么制備標準品的常見方法如下:

☑  DNA 標準品:目的靶點的PCR擴增片段或含有目的靶點的質粒克隆(圖2)。

優點:易于生成、定量,可在適當的儲存條件下維持穩定性。

缺點:無法進行qRT-PCR 的逆轉錄步驟,大大影響了反應效率。

PCR擴增片段:通過常規PCR進行目的片段擴增,回收純化PCR擴增片段,可直接作為標準品,相對于質粒,PCR擴增片段不是那么穩定。

質粒克隆:將目的片段進行PCR擴增,回收目的條帶后連入T載體,再進行質粒提取,OD值定量,將質粒梯度稀釋作為標準品使用。

☑  RNA 標準品:目的靶點的體外轉錄RNA(圖3)

優點:結合了RT效率,最大程度地模擬了目的靶點。

缺點:需要耗費時間生成該標準品,因其不穩定,難以保持長期準確度。

體外轉錄RNA:利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉錄引物重新擴增。體外轉錄反應生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準確定量并稀釋,用于生成標準曲線。

Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統——絕對定量示例

1、實驗方法:

•方法:從組織中提取基因組DNA,以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•標準品:質粒標準品濃度為106、105 、104 、 103 、102、101;3個重復;設陰性空白對照

•實驗步驟:提取gDNA→設計特異引物探針→qPCR擴增→結果分析

2、實驗數據:

3、標準曲線:

R^2=1    y= -3.349x+32.87

關于Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統

來自美國Azure Biosystems公司,以創新服務于生命科學為愿景。Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統融合了高品質Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統,為您的科學研究提供高精準、高靈敏的可靠結果。Azure Cielo-3/6檢測通道,可根據實驗需求靈活配置。同時配有10.3觸控系統,主機本身可獨立運行、連接、遠程交互,讓您隨時隨地知悉實驗進程和及時獲得實驗結果。

發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
聯系電話:0512--86860010
E-mail:info@aperbio.com

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