排查MiSeq的Best Focus和No Usable Signal及其它第一個循環報錯原因

瀏覽次數：2113　發布日期：2022-3-16　來源：Illumina因美納公眾號

如何排查MiSeq™平臺上的Best Focus和No Usable Signal
以及其它第一個循環報錯的原因？

MiSeq™平臺在第一個循環拍照時發生報錯通常表明簇信號強度不夠，儀器不能找到最佳的聚焦平面。

可能的報錯信息包括：
· Best focus not found
· Best focus is too near the edge of range
· No usable signal found, it is possible clustering has failed
· Through-focus peak did not exceed SNR threshold
· Z Motor attempt to move outside soft limits

可能的儀器原因包括：
· 參與簇生成和第一個堿基化學反應試劑的液流問題
· 流動槽溫控問題
· 光學系統問題（這種情況非常少）

可能的文庫和試劑原因包括：
· 使用了過期或者儲存條件不當的試劑
· 文庫設計或者文庫質量/定量問題
· 由于文庫設計問題導致Read1引物雜交不好
· 使用了不合適的引物
· 簇密度過高或者過低

如果已明確是引物問題，而且機器可以聯網，請直接和Techsupport聯系或通過因美納服務與支持公眾號提交需求進行問題排查。

排查第一個循環報錯原因
首先可以按照MiSeq™ System Guide對儀器進行系統檢查，確保儀器的流路、溫度以及機械移動系統正常運行：

1. 對儀器進行Post Run Wash（測序后清洗）
2. 按照使用手冊，重啟機器
3. 去Manage Instrument（管理儀器）界面，點擊System Check（系統檢查）
4. 選擇所有的機械移動系統測試，潤洗試劑流路，溫度梯度以及流路測試

當系統檢查完成，點擊屏幕左下方的Show Details（展開細節）按鈕，得到檢查結果的完整信息。如果是PR2以外的任何流路測試或者其它測試失敗，請發郵件到chinasupport@illumina.com或通過因美納服務與支持公眾號獲得更多技術支持。

如果系統檢查未顯示測試失敗，則要考慮報錯可能是由文庫或者試劑問題導致的。

我們需要分析以下常見問題：
· 檢查試劑盒的有效日期以及正確儲存條件
· 確保文庫設計適合在Illumina平臺測序
· 利用Illumina推薦的方法，檢查文庫質量和濃度
· 確保自定義引物適合MiSeq™平臺65℃的退火溫度
· 確保自定義引物加入到試劑盒正確的孔中（如果加入到已有引物的試劑孔中，sample sheet不需要修改，如果加入到自定義引物的試劑孔中，則Sample Sheet需要選擇自定義引物）

如果文庫或試劑沒有明顯問題，在文庫中摻入20% PhiX重新測序。PhiX可以作為下一次測序簇生成的陽性對照，進而判斷之前的錯誤是否是由文庫問題導致的。

如果下一次測序第一個循環仍舊發生No Usable Signal和Best Focus報錯，可以發郵件到Illumina技術支持郵箱chinasupport@illumina.com或通過因美納服務與支持公眾號獲得更多技術支持。