文章標題：Integrated metabolomics and transcriptomics analysis reveals new biomarkers and mechanistic insights on atrazine exposures in MCF‑7 cells
發表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
發表時間：2022年1月
影響因子：6.291
合作客戶：農科院質標所

百趣生物提供服務：非靶標代謝組學檢測、轉錄組學檢測

1、研究背景
阿特拉津(ATZ)是一種世界范圍內廣泛使用的除草劑，廣泛用于防治高粱、玉米、棉花等作物種植中的禾本科雜草。人類可以通過飲用水和飲食等途徑暴露ATZ。前期研究表明，ATZ可在較低的濃度下促進MCF-7乳腺癌細胞增殖，但其相關機制尚不清楚。本研究利用多組學結合分子生物學技術闡明環境相關濃度下ATZ暴露對MCF-7增殖的影響及可能的分子機制，為內分泌干擾物引起的毒性機制提供新見解。

2、研究結果
（1）不同濃度ATZ對MCF-7的增殖效應

通過CCK8試驗研究不同濃度（100pM-100μM）ATZ對MCF-7細胞暴露48h后的活力影響。結果顯示，與對照組相比，10 nM-100μM ATZ暴露48h后細胞活力顯著增加，其中1μM ATZ暴露后細胞存活率最高，達到149.3%（圖1）。后續試驗選擇1μM作為代謝組和轉錄組分析的暴露濃度。
 

圖1. 不同濃度ATZ對MCF‑7細胞暴露48h后活力的影響

（2）基于代謝組學揭示ATZ暴露對MCF-7代謝的影響
利用UHPLC-QTOF/MS對細胞內代謝物進行代謝組學分析，研究ATZ暴露后代謝譜的變化。在POS和NEG中分別鑒定到957種和1013種代謝物。百趣解讀，作者使用OPLS-DA分析，在正負電離模式下，對照組和ATZ暴露組之間存在明顯差異，表明MCF-7細胞的代謝組學特征在ATZ暴露48小時后受到明顯干擾（圖2）。
 

圖2. POS和NEG離子模式下的OPLS-DA

百趣解讀，火山圖顯示了ATZ暴露組和對照組之間代謝組學差異代謝物的分布。如圖3所示，在ESI+和ESI-模式下，93和58種代謝物上調（紅色圓圈），27和54種代謝物下調（藍色圓圈），其他代謝物沒有顯著變化（灰色圓圈）。
 

圖3. ATZ暴露組和對照組在正離子模式(A)和負離子模式(B)下的火山圖

（3）潛在生物標志物鑒定及代謝通路分析
利用京都基因、基因組百科全書(KEGG)數據庫和人類代謝組數據庫(HMDB)搜索，根據VIP值和P值篩選到34種顯著變化的代謝物，主要包括維生素、氨基酸、脂肪酸及其相應的衍生物。使用MetaboAnalyst對差異代謝物（DM）進行代謝組學代謝通路分析，分別在ESI+和ESI-模式下鑒定到9個和8個代謝途徑（圖4）。這些代謝途徑的改變主要包括維生素代謝組學通路（葉酸一碳代謝、生物素代謝、維生素B6代謝、硫胺素代謝）、氨基酸代謝組學通路（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、賴氨酸生物合成代謝和賴氨酸降解代謝）和脂質代謝組學通路（甘油磷脂代謝，花生四烯酸代謝）。
 

圖4. 在ESI+(A)和ESI‑模式(B)下ATZ暴露顯著影響MCF‑7細胞的通路

（4）轉錄組學揭示ATZ對基因表達的影響
RNASeq結果表明，ATZ暴露后對MCF7細胞內基因的表達產生了影響�；鹕綀D展示了暴露于1µM ATZ后與對照相比差異基因（DEG）的分布，如圖5A所示。在p<0.05和log2FoldChange＞0的條件下共有1784個上調基因和1329個下調基因。顯著富集的GO主要與細胞成分有關（如圖5B所示）。KEGG通路富集分析顯示，百趣解讀，DEG主要富集于癌癥通路和癌癥蛋白聚糖（如圖5C，D所示）。
 

圖5. ATZ暴露MCF-7后轉錄組學分析

（5）DM和DEG的關聯網絡分析
百趣解讀，為了進一步研究轉錄組水平的代謝反應機制，使用Cytoscape（v3.6.1）構建了ATZ誘導的分子相互作用網絡。在該網絡中，FTCD(亞胺甲基轉移酶環化脫氨酶)和葉酸通過葉酸一碳代謝表現出最顯著的變化（如圖6所示）。葉酸一碳代謝支持細胞分裂中的多種生理過程，如10-甲酰5,6,7,8-四氫葉酸(THF)合成。THF是葉酸在體內的主要形式，ATZ暴露導致的FTCD的下調可減緩THF的代謝，而MTHFD1表達的增加有助于10-甲酰THF合成和嘌呤合成的增加。葉酸和不同形式的THF參與嘌呤的合成，這與MCF-7細胞增殖過程中需要大量核苷酸是一致的。
 

圖6. DM和DEG的網絡分析

此外，ATZ對DNA甲基化發生了重要影響，這一過程受其底物(蛋氨酸和半胱氨酸)、輔因子(葉酸、維生素B12和維生素B6)和中間體(SAM、SAH和同型半胱氨酸)的調節。與百趣生物非靶向代謝組學鑒定出的4種顯著變化的代謝物，葉酸、吡哆醛（維生素B6的組成成分之一）、1‑脫氧‑D‑木酮糖5‑磷酸和S‑腺苷‑L‑高半胱氨酸的結果一致（如圖7）。葉酸和吡哆醛可作為ATZ暴露的生物標志物。
 

圖7.由葉酸、7,8‑二氫葉酸  (DHF)、5,6,7,8‑四氫葉酸(THF)和反式硫化途徑組成的單碳代謝途徑

3、研究結論
百趣解讀，本研究利用多組學和分子生物學技術闡明環境相關濃度下ATZ暴露對MCF-7增殖的分子機制。基于代謝組學分析，共鑒定出34種顯著變化的代謝物，包括維生素、氨基酸、脂肪酸和相應的衍生物。葉酸和吡哆醛為ATZ暴露的潛在生物標志物，葉酸一碳代謝組學通路為顯著改變的代謝途徑。最后，代謝變化中的關鍵代謝物和相關差異表達基因調控共同揭示了ATZ暴露后MCF-7細胞增殖的分子機制。該研究為理解內分泌干擾物的毒性效應提供了新的見解。

文/阿趣代謝組學