采用聚合酶鏈反應(yīng)等手段在體外獲得成套抗體可變區(qū)輕重鏈基因，將這些基因重組入一定的載體，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞或噬菌體中，這些抗體基因克隆的集合體稱為抗體文庫。從該文庫中能夠表達(dá)和篩選出所需的單克隆抗體。

納米抗體文庫就是將抗體文庫構(gòu)建過程中的抗體序列換成了納米抗體的序列，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞或噬菌體中即可得到相應(yīng)文庫。

納米抗體文庫的分類和傳統(tǒng)抗體文庫的分類一致，都可分為——免疫文庫，天然文庫和合成文庫。下邊我們一一介紹：

免疫納米抗體文庫就是要用特異的抗原對駝科動(dòng)物進(jìn)行免疫，通常需要免疫5次，大概需要6-8周，免疫之后取頸靜脈血，分離PBMC/淋巴細(xì)胞提取rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，擴(kuò)增VHH基因序列，將基因序列克隆至噬菌體展示載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌即可獲得免疫文庫，文庫庫容通過長出的轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)來確定。之后利用該展示文庫篩選表達(dá)目的抗體的噬菌體，去除不表達(dá)目的抗體的噬菌體，通過pcr擴(kuò)增和單克隆測序來檢測文庫的抗體基因插入率和文庫多樣性。

圖1 免疫納米抗體文庫

在一些抗原無法進(jìn)行免疫的情況下（比如抗原沒有免疫原性或者抗原含有毒性），天然納米抗體文庫就比較有優(yōu)勢了。

天然文庫不需要制備抗原對動(dòng)物免疫，僅僅采集年輕健康的駝科動(dòng)物的頸靜脈血分離淋巴細(xì)胞提取RNA或者提取脾臟的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，對VHH抗體的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將基因片段克隆至嗜菌粒載體上，轉(zhuǎn)化TG1即可獲得天然納米抗體文庫。因?yàn)槭褂昧耸染�粒載體，所以需要用輔助噬菌體（M13KO7、R408和 VCSM13）進(jìn)行超染，才能使插入的基因展示在噬菌體表面。之后確定庫容、篩選、鑒定文庫的抗體基因插入率和文庫多樣性和之前說過的免疫納米抗體文庫的方法一致。

圖2 天然納米抗體文庫

然而為了得到高親和力的抗體，通常需要構(gòu)建一個(gè)庫容達(dá)到10⁹-10¹⁰文庫并且其中高于80%的克隆應(yīng)該都可以編碼納米抗體。為了構(gòu)建一個(gè)庫容較大且文庫多樣性豐富的天然納米抗體文庫，需要同時(shí)從不同的駝科動(dòng)物抽取大量頸靜脈血（如果想獲得10¹⁰不同的VHH克隆，大概需要大于10升的血液），這也導(dǎo)致工作量的增加。因此，構(gòu)建多樣性豐富的合成納米抗體庫是更有意義的。

納米抗體合成庫的構(gòu)建核心是人為創(chuàng)造出具有多樣性的VHH片段，大致流程如下：

(1) 選擇蛋白框架：與來自動(dòng)物宿主的每個(gè)納米體都有自己的框架區(qū)域不同，來自合成納米體庫的所有納米體都需要共享相同的框架區(qū)域序列。共享的框架需要是穩(wěn)定的、易表達(dá)的、高度通用的。納米抗體合成庫基本的框架是一致的，一種名為cAbBCII10的天然納米抗體已被測試為合成納米抗體文庫框架的良好選擇。

(2) 模板確定；

(3) 通過引物設(shè)計(jì)在CDR隨機(jī)突變：文庫的多樣性體現(xiàn)在CDR，要確定突變CDR區(qū)的數(shù)量、每個(gè)CDR區(qū)的長度。一般CDR3區(qū)是確定親和力和特異性的主要區(qū)域，可以僅對CDR3區(qū)突變，CDR3區(qū)可設(shè)計(jì)多個(gè)長度。為了防止插入終止密碼子或者發(fā)生移碼突變，目前通常使用三聯(lián)核苷酸突變技術(shù)來合成引物。

(4) 合成模板和引物：考慮到合成庫的有效性，需要保留重要氨基酸位點(diǎn)，比如形成二硫鍵Cys位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物中應(yīng)包含多樣性的CDR區(qū)和重疊延伸時(shí)片段之間的重疊序列。

(5) 采用不對稱和重疊PCR合成多樣性的VHH片段：合成隨機(jī)引物時(shí)，引物合成公司將在每個(gè)特定的位點(diǎn)添加混合堿基，每一個(gè)混合堿基池都是可以按一定比例定制。對于不同長度的CDR區(qū)，可以將每個(gè)長度制備成一個(gè)混合池，這些池可以在以后以特定的比例進(jìn)一步混合，利用PCR技術(shù)重組VHH片段。

之后的文庫篩選和驗(yàn)證也和之前講過兩種文庫的相一致。

圖3 合成納米抗體文庫構(gòu)建及驗(yàn)證