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由來自澳門科技大學的XingXia Wang，Wei Hu，LiQun Qu以及Betty Yuen Kwan Law等多名研究人員在期刊Pharmacol Res上，共同發表了題為“Tricin promoted ATG-7 dependent autophagic degradation of α-synuclein and dopamine release for improving cognitive and motor deficits in Parkinson's disease”的文章，在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的Tricin（苜蓿素，M5206），揭示了Tricin通過AMPK-p70s6K和ATG7依賴機制誘導自噬降解和多巴胺釋放，從而改善帕金森病的認知和運動障礙的新機制。

帕金森病（PD）是最常見的神經系統退行性疾病之一，但目前的手段只能緩解癥狀。而通過促進突變蛋白的降解，以防止多巴胺能神經元變性將是改善帕金森病的一種潛在方法。

研究人員首先通過熒光測量和流式細胞儀分析，證實Tricin能增強自噬作用（圖1A），提高 PC12 細胞中 LC3-II 的水平（圖1B）。并發現自噬體形成抑制劑能阻斷Tricin處理的細胞中蛋白質向 LC3-II 的轉化（圖1C-D），提示Tricin能在細胞水平誘導自噬。

圖 1 (A) 在 PC12 細胞中使用自噬檢測試劑盒進行 MDC 染色。陽性對照（Rapamycin，400 nM）和Tricin（20-80 μM）給藥 24 小時，流式細胞儀對 MDC 的熒光信號進行定量。(B) 給 PC12 細胞注射Tricin（20-80 μM）24 小時，并通過免疫印跡（WB）分析 LC3-II 的蛋白表達。(C）Wortmannin對Tricin處理細胞中 LC3-II 轉化的影響。PC12 細胞用 DMSO 或 60 μM 的Tricin處理 24 小時，同時添加或不添加 1 μM的Wortmannin。(D) PC12 細胞在有或沒有Bafilomycin A1（Baf A1，50 nM）的情況下用 DMSO 或 60 μM 的Tricin處理 24 小時。

隨后，研究人員利用轉染mRFP-GFP-LC3的U87細胞和秀麗隱桿線蟲模型（2A-B）進一步確定了 Tricin的自噬誘導效應。通過將Tricin與 PC-12 細胞孵育，并使用Western 印跡檢測 p-AMPK/AMPK 和 p-P70s6K/p70s6K 的蛋白表達。證實Tricin能通過 AMPK-p70s6K 依賴性信號通路誘導自噬。

圖 2 (A) U87-mRFP-GFP-LC3 穩轉細胞經 20-60 μM 的Tricin處理 24 小時。圖中顯示了 3 個獨立實驗中每組細胞中 mRFP-LC3 點的合并定量。(B) 用 elegans 模型 DA2123（LGG-1::GFP）和模型 BC12921（SQST-1/p62::GFP）通過熒光分析 GFP 標記的目標蛋白來評估Tricin的自噬活性。Rapamycin（20 μM）作為陽性對照。

此外，通過使用RT-PCR 陣列對自噬相關基因進行分析（圖 3A- B），并進行進一步的 STRING 分析預測，發現 Tricin能提高一系列自噬基因的水平，并可通過 ATG7 依賴性機制誘導自噬。

圖 3 (A) PCR 陣列結果的散點圖。(B) 表格顯示 mRNA 水平發生顯著變化（> 1.5 倍）的自噬基因。

隨后，研究人員使用試劑盒測定經Tricin處理后 SH-SY5Y 細胞中 α-syn 的水平（圖 4A），并在 Schrodinger 中進行Tricin與α-syn 的對接模擬（圖 4B），發現Tricin能和 α-syn 直接結合，并具有良好的結合親和力，Kd 值為 13.76 μM（圖 4C）。此外，通過進一步研究證實了Tricin能通過ATG7 依賴的自噬作用降低突變體 α-syn 的水平。

圖 4 (A) 在SH-SY5Y細胞中，施用Tricin（0-100 μM）24小時后，使用人α-syn ELISA試劑盒。并通過酶標儀定量熒光強度。(B) 分子對接顯示Tricin與 α-syn 的結合傾向。 (C) 生物層干涉測量法（BLI）顯示Tricin與 α-syn 的結合傾向（Kd 值）。

接下來，研究人員構建 A53T-α-syn 轉基因PD小鼠模型（圖5），并通過行為學實驗證實Tricin能改善PD小鼠的運動，記憶以及認知能力。隨后組織學實驗（H&E 及Nissl染色）結果說明Tricin能夠改善 PD 轉基因小鼠的組織病理學情況。

圖 5 動物實驗時間圖。

最后，通過ELISA，UPLC-MS以及Western 印跡法等多種方法進一步研究發現，在Tricin給藥組的血清和腦樣本中 DA 含量升高（圖6A-B），血清中的炎性細胞因子水平顯著下降（圖6C），表明Tricin能減輕PD小鼠的炎癥反應。此外，Tricin處理組小鼠紋狀體中TH蛋白的表達量明顯增加（6D），表明Tricin能通過上調酪氨酸羥化酶（TH）來提高PD小鼠的DA水平，從而發揮其神經保護作用。

圖 6 Tricin能提高A53T轉基因PD小鼠多巴胺和自噬標記物的水平，并可降低炎性細胞因子和 α-syn的水平。(A）用小鼠多巴胺（DA）ELISA試劑盒評估各組小鼠的血清多巴胺水平。(B) 用 UPLC-MS 分析小鼠大腦中的多巴胺水平。 (C) 按指示進行酶聯免疫吸附試驗檢測炎癥標記物。流式細胞術用于檢測各組小鼠血清中炎癥因子的表達。(D) 通過 Western 印跡分析各組小鼠紋狀體中 LC3-Ⅱ、TH和 α-syn 的蛋白水平。條形圖表示 LC3-Ⅱ、TH 和 α-syn 水平與 β-actin 的歸一化。

研究人員在該研究中多次使用了購自AbMole的Tricin（苜蓿素，M5206），該產品是一種天然無毒的黃酮類化合物，可清除自由基，并具有抗炎和抗氧化活性。

研究人員將不同濃度的Tricin與 PC-12 細胞孵育，并通過 Western 印跡檢測 p-AMPK/AMPK 和 p-P70s6K/p70s6K 的蛋白表達。結果顯示，Tricin能以劑量依賴的方式顯著降低 mTOR 底物 p70s6K 的磷酸化形式，而不改變總 p70s6K 的水平（圖7A）。此外，它還增加了 p-AMPK 的表達，而不改變 AMPK 總形式的表達。為了進一步確認Tricin是否通過 AMPK-p70s6K 信號通路誘導自噬，研究人員在Tricin存在的情況下加入了 AMPK 抑制劑（compound C）（圖 7B- C） ，發現雖然Tricin增加了細胞中 LC3-II、p-AMPK 和 GFP-LC3 點的表達水平，但compound C 的存在能抑制這些作用，證實Tricin能通過 AMPK-p70s6K 依賴性信號通路誘導自噬。

圖 7 Tricin能激活AMPK-p70s6K 信號通路。(A) PC12 細胞經Tricin（0-80 μM）處理。然后收獲細胞裂解液，分析 p-AMPK、總 AMPK、p-P70s6K 和總 p70s6K。磷酸化形式的 AMPK 和 p70s6K 的條帶強度通過與相應的總形式進行歸一化來量化。(B) PC12 細胞經 60 μM 的Tricin和 5 μM 的compound C（CC）處理 24 小時。條形圖表示 LC3-II 與 β-actin和 p-AMPK 與總 AMPK 水平的歸一化。(C）U87-GFP-LC3 穩轉細胞用Tricin（60 μM）處理，同時添加或不添加 CC。然后用熒光顯微鏡分析細胞。

此外，H&E 染色顯示，模型組的錐體細胞雜亂無章，有壞死細胞。而Tricin處理組（40 mg/kg和60 mg/kg）和左旋多巴組在CA1區和皮質區細胞的壞死細胞更少。在 WT 組中，Nissl 染色顯示 CA1區和皮質區有清晰的胞漿染色和豐富的 Nissl 體。與 WT 組相比，模型組的 CA1 和皮質區顯示出 Nissl 體的缺失。相比之下，Tricin處理組的錐體細胞胞漿中有更多的Nissl 體染色，表明Tricin能夠改善 PD 轉基因小鼠的病理學狀態。

綜上所述，類黃酮Tricin能通過AMPK-p70S6K和ATG7依賴途徑增強自噬作用，加速α-syn降解，改善轉基因帕金森病小鼠的行為、學習和記憶能力，減少炎癥細胞因子的過度釋放，該實驗對帕金森的進一步研究具有重要意義。

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鳴謝：Wang X, Hu W, Qu L, et al. Pharmacol Res. 2023 Oct;196:106874.