小量全血DNA提取方法
儲存事項:
1. 結合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中發生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
如果全血起始量小于200μl，則用緩沖液BB補足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間，則后續操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間，則需要先進行紅細胞裂解操作（見本說明書后附錄）。
2. 加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。溶液應變清亮（但顏色偏黑色）。
可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
3. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻。
4. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。
6. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
7. 加入500μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
8. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
9. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。
10. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。
附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細胞裂解操作）：
1. 吸取900μl紅細胞裂解液到一個1.5ml離心管或者3ml紅細胞裂解液到一個15ml離心管。（紅細胞裂解液可向本公司購買）
2. 將抗凝全血（使用前回復到室溫）顛倒混勻后，吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。
3. 室溫放置10分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次，幫助裂解紅細胞）。
4. 12,000 rpm離心20秒（對于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對于15ml離心管），倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團和大約10μl的殘留上清。
離心后在管底應該見到白色的白細胞團，也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細胞團，說明紅細胞裂解很不充分，應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟3，4。
5. 加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細胞團，充分分散白細胞團。
其中由于肝素抗凝血的白細胞沉淀團很難打散重懸，影響后續實驗裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標本。
6. 現在可以按照操作步驟提取全血基因組DNA了。
標簽：
全血DNA提取方法
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