Northern blot實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)方法
- Northern blot技術(shù)
- Northern Blot
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標(biāo)記DNA或RNA特異性探針對(duì)固定于固相膜上的mRNA進(jìn)行雜交，洗膜去除非特異性結(jié)合雜交信號(hào)，經(jīng)放射自顯影或現(xiàn)色反應(yīng)，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標(biāo)準(zhǔn)分子量分子進(jìn)行比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小；對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱比較，可以知曉該基因表達(dá)mRNA水平的強(qiáng)弱。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
DNA |
| 試劑、試劑盒 |
MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器、耗材 |
水平電泳儀 制冰機(jī) 恒溫水浴箱 凝膠成像系統(tǒng) EP管 移液器 Tip頭 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、RNA轉(zhuǎn)移與固定
1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。 2. 按southern blot實(shí)驗(yàn)中DNA轉(zhuǎn)移方法及裝置轉(zhuǎn)移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時(shí)。
4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍(lán)溶液中浸泡5~10 min。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標(biāo)準(zhǔn)及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標(biāo)記。 二、預(yù)雜交、雜交及顯色
1. Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。
7. 當(dāng)出現(xiàn)條帶時(shí)，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現(xiàn)色。 8. 照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。
9. 掃描計(jì)算EGFR基因擴(kuò)增的倍數(shù)。 |
| 注意事項(xiàng) |
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝膠中最好不要加入EB，以免降低雜交的效率。 3. 為降低膜雜交本底，可適當(dāng)延長預(yù)雜交時(shí)間。 |
標(biāo)簽：
RNA
northern blot
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