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多功能酶標(biāo)儀技術(shù)的革命——LVF光柵在FRET和BRET分析中的優(yōu)異表現(xiàn)

瀏覽次數(shù)：6932　發(fā)布日期：2014-11-10　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

在多功能酶標(biāo)儀中，為了分離某一特定波長(zhǎng)的單色光我們有兩種技術(shù)選擇——濾光片或者光柵。與光柵相比，濾光片系統(tǒng)往往具有更好的靈敏度，因?yàn)闉V光片具有更好的透光率和更寬的帶寬。而光柵系統(tǒng)的好處是可以提供波長(zhǎng)選擇的靈活性，不需要購買或安裝特定波長(zhǎng)的濾光片。盡管如此，很多用戶都發(fā)現(xiàn)許多應(yīng)用在光柵系統(tǒng)上達(dá)不到理想的效果，有些應(yīng)用甚至根本無法實(shí)現(xiàn)。

例如在檢測(cè)GFP，mKate，mOrange和CFP-YFP等熒光蛋白時(shí)，光柵型酶標(biāo)儀得不到理想的效果，在FRET和BRET等雙發(fā)射分析中更是如此。光柵型酶標(biāo)儀無法實(shí)現(xiàn)這些應(yīng)用的一個(gè)明顯原因是我們需要30nm以上的帶寬，實(shí)際上，在一些BRET分析中我們需要60到100nm的帶寬，而目前傳統(tǒng)的光柵往往只有狹窄的固定的帶寬或者有限可調(diào)的帶寬（不超過30nm），根本無法滿足檢測(cè)要求。另一個(gè)原因是這些應(yīng)用的信號(hào)比較弱，發(fā)射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于常用的染料，如FITC或者rhodamine，而光柵的透光效率又遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于濾光片，光強(qiáng)損失太大，勢(shì)必降低靈敏度。

為了既滿足波長(zhǎng)選擇的靈活性又能得到更高的靈敏度，德國BMG LABTECH公司的工程師們研發(fā)出了革命性的線性漸變?yōu)V光片光柵，簡(jiǎn)稱LVF光柵（Figure 1）。

LVF光柵技術(shù)包含一塊線性漸變短波通濾光片和一塊線性漸變長(zhǎng)波通濾光片，當(dāng)兩塊線性漸變?yōu)V光片恰當(dāng)排列的時(shí)候我們不僅能分離得到特定波長(zhǎng)的光線，還能實(shí)現(xiàn)8到100nm帶寬的任意選擇。LVF光柵可以輕松實(shí)現(xiàn)以前需要濾光片才能完成的分析，例如FRET和BRET。

LVF光柵的高靈敏度除了因?yàn)楦鼘挼膸挘€有兩個(gè)原因，一是LVF光柵是基于濾光片的透射原理而不是傳統(tǒng)光柵的衍射；二是由于光路設(shè)計(jì)的不同， LVF光柵通過直接的光學(xué)組件取代光纖來傳導(dǎo)信號(hào)（光纖傳導(dǎo)會(huì)造成光強(qiáng)的損失）；因此，LVF光柵可以提供比傳統(tǒng)衍射光柵多5到10倍的光線，從而大大提高了靈敏度。目前LVF光柵已經(jīng)被運(yùn)用于BMG最新一代的多功能酶標(biāo)儀——CLARIOstar。

	對(duì)于科研工作者來說，一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)是如何將基于顯微鏡的熒光蛋白分析轉(zhuǎn)化為基于微孔板的分析。現(xiàn)在有了LVF光柵我們可以在多功能酶標(biāo)儀上選擇與顯微鏡相同的波長(zhǎng)和帶寬，從而實(shí)現(xiàn)顯微鏡和酶標(biāo)儀之間的無縫銜接。

	例如，F(xiàn)igure 2顯示的是分別用共聚焦顯微鏡和CLARIOstar檢測(cè)HEK293細(xì)胞中mTFP1和YFP之間的FRET。在顯微鏡上，我們選擇波長(zhǎng)480nm、帶寬30nm和波長(zhǎng)535nm、帶寬45nm的兩塊濾光片來分別檢測(cè)mTFP1和YFP的信號(hào)，在CLARIOstar上，我們通過LVF光柵選擇相同的波長(zhǎng)和帶寬做為起點(diǎn)，經(jīng)過優(yōu)化之后我們?cè)诿笜?biāo)儀上得到了與共聚焦顯微鏡相同的FRET效率，從而實(shí)現(xiàn)了從顯微鏡分析到高通量微孔板分析的無縫轉(zhuǎn)化。

另一個(gè)說明LVF光柵可以媲美濾光片的應(yīng)用是BRET，跟FRET一樣，BRET也需要同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)發(fā)射光信號(hào)，不同的是往往需要更大的帶寬（60到100nm），因此，由于帶寬的限制，傳統(tǒng)的光柵型酶標(biāo)儀基本無法實(shí)現(xiàn)BRET分析。然而，CLARIOstar的LVF光柵卻可以得到媲美濾光片的結(jié)果（Figure 3）。

LVF光柵是目前市場(chǎng)上唯一可以實(shí)現(xiàn)任意波長(zhǎng)，任意帶寬選擇的酶標(biāo)儀技術(shù)，這種突破性的設(shè)計(jì)使得CLARIOstar可以實(shí)現(xiàn)任意的熒光和發(fā)光檢測(cè)，做到“任何波長(zhǎng)、任何帶寬、何任檢測(cè)”都可以輕松實(shí)現(xiàn)！

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