目前，將RNAi庫和基于細(xì)胞水平的高通量分析技術(shù)相結(jié)合對于我們鑒定藥物敏感性和抵抗性的新機(jī)制有非常廣闊的前景。舉例來說，已有研究者對全基因組進(jìn)行RNAi篩選找出了導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌對紫杉醇敏感的基因。這項(xiàng)研究也證實(shí)了RNAi技術(shù)在發(fā)現(xiàn)影響癌癥細(xì)胞細(xì)胞有絲分裂的靶點(diǎn)上具有很大潛力。

 

Molecular Devices公司開發(fā)了一款非常強(qiáng)力的篩選平臺(tái)—ImageXpress系統(tǒng)。該系統(tǒng)擁有完整的圖像獲取及分析模塊，可以快速生成想要的數(shù)據(jù)。

 

本文我們列舉了如何通過對磷酸化的組蛋白H2AX和DNA進(jìn)行免疫熒光雙色分析方法來檢測DNA損傷。組蛋白H2AX在絲氨酸139位點(diǎn)的磷酸化被認(rèn)為是藥物或輻射造成的DNA損傷的敏感標(biāo)記。文中也闡明了我們利用RNAi對雙色標(biāo)定DNA損傷分析是一個(gè)敏感和快速的自動(dòng)化過程，而且這種方法被證明可以有效發(fā)現(xiàn)新的目標(biāo)。圖1列舉了這種分析的設(shè)置方法。

 

圖1 通過標(biāo)記磷酸化組蛋白H2AX檢測DNA損傷的示意圖

 

細(xì)胞及其培養(yǎng)條件。用加入10%FCS的DMEM培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。細(xì)胞移入384孔避光且底面光潔的聚苯乙烯板(Greiner)中，密度為每孔約600個(gè)細(xì)胞。

 

利用ImageXpress系統(tǒng)檢測DNA損傷。在經(jīng)過RNAi及/或DNA損傷處理后，細(xì)胞固定，打孔并用相應(yīng)抗體直接免疫染色組蛋白H2AX的絲氨酸139的磷酸化位點(diǎn)。所用二抗為抗兔Alexa Fluor-488(AF-488，Invitrogen)，propidium iodide(PI)標(biāo)記所有的細(xì)胞核。ImageXpress激光掃描平臺(tái)設(shè)置為綠色濾光通道(Ch1,510-540nmBP)及紅色濾光通道(Ch3,600nm LP)。利用紅色通道的逐區(qū)掃描可以對全板孔圖像進(jìn)行分析，背景則由整合了綠色及紅色通道的熒光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整和修正。在圖2中我們列舉了陽性和陰性樣本的圖像。

 

圖2 利用ImageXpress系統(tǒng)對DNA損傷實(shí)驗(yàn)的陰性和陽性孔進(jìn)行整空成像，細(xì)胞生長于384孔板，左側(cè)為綠色通道，右側(cè)為紅色通道。

 

結(jié)果及討論

我們整合了ImageXpress 系統(tǒng)和機(jī)械加樣臂對超過20000個(gè)RNAi進(jìn)行篩選（數(shù)據(jù)庫由斯坦福大學(xué)Karlene Cimprich 實(shí)驗(yàn)室提供）。我們的平臺(tái)可以通過雙色圖像處理技術(shù)同時(shí)自動(dòng)化處理圖像以及定量分析細(xì)胞的DNA損傷狀況。

 

圖3 陰性(上)和陽性(下)細(xì)胞分析結(jié)果的散點(diǎn)圖如圖所示。紅色的斜線為Ch3/Ch1，表示DNA損傷的閾值。陰性損傷比率為1.9%，陽性的比率為88.5%。

 

圖4 展示了按照384孔板布局排布的RNAi篩選DNA損傷的百分比結(jié)果。陰性對照空(8個(gè))標(biāo)記為灰色，陽性對照孔(8個(gè))標(biāo)記為綠色。Z’值為0.9，其他RNAi處理孔的損傷率為13.5%，標(biāo)記為橙色。

 

圖2中列舉的用磷酸化H2AX和PI染色細(xì)胞作為陰性和陽性對照，我們在圖3中展示了其雙參數(shù)點(diǎn)陣圖結(jié)果。紫色分割線代表Ch3/Ch1的比率，其X軸截距可調(diào)節(jié)，而這一比率定義了自動(dòng)化DNA損傷定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)。其中陰性對照樣本的比率為1.9%而陽性對照樣本(已經(jīng)用RNAi技術(shù)處理過增加了DNA損傷幾率)的比率為88.5%。

圖4中我們列舉了具有代表性的384孔細(xì)胞的DNA損傷百分率。陰性對照孔(n=8)用灰色表示，陽性對照孔(n=8)用綠色表示。Z’-prime值為0.9。其余用RNAi處理的和比率大于等于13.5%的孔則用橙色表示。

 

結(jié)論

H2AX的磷酸化已經(jīng)被證實(shí)是檢測離子照射和藥物所致DNA雙螺旋損傷的早期敏感標(biāo)志。本文我們展示的ImageXpress激光掃描平臺(tái)可以通過雙色檢測對DNA損傷進(jìn)行定量。我們也闡述了這種雙色DNA損傷檢測具有高速，自動(dòng)化，靈敏的特點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)好的RNAi，我們可以篩選誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞致DNA損傷的目的基因。此平臺(tái)獨(dú)特的光學(xué)和掃描工具可以實(shí)現(xiàn)簡單的“插入電源然后工作”的操作，這也同時(shí)滿足了學(xué)術(shù)和工業(yè)領(lǐng)域生命科學(xué)研究者們的需求。