免疫熒光必備ProLong Gold & SlowFade Gold抗淬滅效果比照明細(xì)

瀏覽次數(shù)：3704　發(fā)布日期：2015-7-22　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

如果熒光染色的目標(biāo)分子豐度比較低或者樣本在強(qiáng)激發(fā)光下長時間放置，很容易出現(xiàn)明顯的光漂白作用，即熒光淬滅作用。Life Technologies公司專門開發(fā)了 ProLong 和 SlowFade 兩個系列抵抗熒光信號淬滅的試劑。其主要原理是可以有效避免熒光染色后的固定細(xì)胞或組織等樣品不被氧化，從而防止熒光淬滅導(dǎo)致的熒光信號減弱現(xiàn)象。

ProLong系列抗淬滅試劑則能提供給樣品熒光信號數(shù)月的保護(hù)，只要將樣品封片放置在干燥避光的環(huán)境下，熒光信號可以在一年甚至更長時間內(nèi)不減弱或是淬滅。但該系列產(chǎn)品在處理樣品以后必須室溫避光放置 24 小時才能進(jìn)行觀察和圖象記錄，否則其熒光顏色會因折光律的改變而與實際顏色有所不同（圖 1）。

SlowFade系列抗淬滅試劑處理樣品后可以直接進(jìn)行觀察與圖象記錄，其可保證熒光信號在 3 到 4周內(nèi)不明顯減弱，如果適當(dāng)封片還可以延長更多時間。

抗淬滅劑使用簡便，只需加 1 滴至玻片即可。

Figure 1. ProLong® Gold 在凝固的過程中折射率不斷增加

Figure 2. ProLong® Gold (圖 A) and SlowFade® Gold (圖 B)

抗淬滅劑有效防止光漂白用不同的抗淬滅劑將 FITC 標(biāo)記的微球封片，

100 瓦貢弧燈照射 30 秒，40x/1.3 NA 油鏡觀察，

12-bit 單色 CCD 成像。取20 個微球的平均熒光強(qiáng)度作圖。

ProLong® Gold 和 SlowFade® Gold 的抗淬滅效果：

（以 40X/1.3 NA 物鏡 100 瓦貢弧燈連續(xù)照射 30 秒后，與初始熒光強(qiáng)度相比的百分率表示）

操作步驟：

抗淬滅劑適用于多數(shù)的固定樣品，但由于含有甘油，不適于某些用途，如親脂的膜染料 Dil。

1．1 預(yù)溫試劑：

從冰箱中取出試劑，平衡至室溫；不推薦使用其他的熱源，這樣會降低產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

1．2 加封片介質(zhì)（抗淬滅劑）：

將切片上多余的液體去除，加 1 滴（或適量）抗淬滅劑，蓋上蓋玻片；樣本固定在蓋玻片上的，加1 滴抗淬滅劑于干凈的玻片上，小心將蓋玻片放到滴有淬滅劑的位置，避免產(chǎn)生氣泡。

1．3準(zhǔn)備觀察：

用 ProLong 封片的，將玻片置于黑暗干燥處待其凝固，時間從幾個小時到過夜，依樣本的厚度和環(huán)境的相對濕度而不同。推薦凝固 24 小時。若需長期貯存，在凝固后將蓋玻片的邊緣封住，防止封片劑收縮使樣品扭曲變形。封好后，將玻片豎直存放在有蓋的玻片盒中，室溫、4℃或≤-20℃保存，加入干燥劑。若需馬上觀察，用指甲油或熱蠟固定蓋玻片的一角防止移動，邊緣保持干凈便于凝固。凝固后再將邊緣封好便于長期保存。

用 SlowFade 封片的，可立即觀察。較厚的樣品，要等到試劑完全滲透。必要時也可以用指甲油或熱蠟固定蓋玻片的一角后觀察。

熒光顯微鏡的設(shè)置：

樣本在抗淬滅劑干燥之前也可以觀察，但二者接觸的越久，抗淬滅的效果越好，尤其是 ProLong，其折射率也會有變化。減少在光下的暴露時間，用中等強(qiáng)度的濾光片，僅在觀察和記錄圖像時光照。保證好的成像效果，拍照時用最小光學(xué)、最高數(shù)字的光圈，較低的放大倍數(shù)，高質(zhì)量的光學(xué)濾片，高速膠片和高效的鏡頭。

另外，ProLong® Gold 和 SlowFade® Gold 抗淬滅劑還有含 DAPI 的型式，減少了復(fù)染 DNA 的步驟。