5’末端DNA探針同位素（[γ³²P]ATP）激酶標記試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

5’末端DNA探針同位素（[γ³²P]ATP）激酶標記試劑是一種旨在針對目標片段DNA、寡核苷酸引物、銜接體（LINKER）、線性載體等，使用多聚核苷酸激酶的正向反應，進行5’末端同位素標記處理的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其應用于后續雜交、測序、電泳標記、DNA連接反應、DNA修飾檢測等實驗。適用于各種粘性外凸或凹入、平滑末端等DNA分子的標記。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，反應敏感，重復性好。

技術背景

源自于大腸桿菌重組的噬菌體T4 pseT基因的T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase；T4 PNK）是多聚核苷酸5’羥基激酶，為同源四聯體，分子量為28.9kD。催化ATP上的γ磷酸基團轉移到單鏈或雙鏈DNA分子上的羥基基團的正向反應（forward reaction）。

產品內容

緩沖液（Reagent A）   3毫升

反應液（Reagent B）       50微升

激酶液（Reagent C）       20微升

濃縮液（Reagent D）   1毫升

助沉液（Reagent E）  20微升

沉淀液（Reagent F）   5毫升

凈化液（Reagent G）  15毫升

產品說明書       1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent A）、濃縮液（Reagent D）、沉淀液（Reagent F）和凈化液（Reagent G）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

DNA片段：用于連接和克隆的目標DNA分子

[γ³²P]ATP同位素：用于同位素標記

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

恒溫水槽或培養箱：用于孵育或終止反應

震蕩器：用于混勻反應物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

液體閃爍計數器（liquid scintillation counter）：用于同位素活性測定

實驗步驟

實驗開始前，完成好目標DNA分子的去磷酸化和膠純化等操作。并將恒溫水槽打開，分別設置37℃和68℃。同時將－20℃保存的試劑，置于冰槽里融化.然后進行下列操作：

• 目標DNA分子標記
• 準備1個1.5毫升離心管
• 按照下表依次加入反應物：

• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃恒溫水槽孵育45分鐘
• 放進68℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 置于室溫下，靜置15分鐘

標記DNA分子純化

• 加入54微升緩沖液（Reagent A）
• 加入25微升濃縮液（Reagent H）
• 加入1微升助沉液（Reeagent I）
• 加入200微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管，標記為S1管（上清液）
• 加入700微升凈化液（Reagent K）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到上述S1管
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入50微升緩沖液（Reagent A），直至溶解，標記為D1管（DNA）
• 放進－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

放射性活性測定

• 準備3個1.5毫升離心管，分別標記為：S2、D2和R（同位素母液）管
• 移取1微升上述S1管里的上清液到S2管（此為未整合CPM）
• 移取0.5微升上述D1管里的DNA懸液到D2管（此為整合CPM）
• 移取0.5微升同位素[γ³²P]ATP母液到R管（此為總CPM）
• 即刻放進液體閃爍計數器測定
• 獲得CPM值
• 計算放射性特異活性（Specific Activity）和標記效率（Efficiency of Incorporation）

St＝實際CPM  X  500（稀釋倍數）

Dt＝實際CPM  X  50（稀釋倍數）

Rt＝實際CPM  X  2（稀釋倍數）

標記效率％（Efficiency of Incorporation）＝（Dt÷Rt）X100％或【Dt÷（Dt＋St）】X100％

特異活性（Specific Activity）＝Dt÷0.5（微克，DNA量）

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 同位素操作須嚴格遵守規章制度
• 建議使用帶濾芯的槍頭進行分子操作
• 用戶自備的目標DNA分子均須去磷酸化處理，例如小牛小腸堿性磷（calf intestinal alkaline phosphatase；CIAP），而未經去磷酸化處理的樣品可以進行交互反應（exchange reaction），但效率欠佳
• 建議用戶自備的目標DNA分子予以膠純化處理
• 用戶自備的目標DNA分子避免使用醋酸胺和高濃度NaCl等處理
• 同位素³²P標記的γATP，建議使用AMERSHAM（安瑪西亞）公司
• 建議使用新鮮同位素材料
• 建議探針標記后即刻使用
• 建議使用螺旋蓋的離心管制備同位素探針
• 標記探針可保存在－20℃冰箱里。其半衰期為28天
• 理想標記總活性為大于1 X 10⁸ CPM/微克DNA；整合效率為20至60％
• 本公司提供系列同位素處理試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶