在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)直接影響魚(yú)類(lèi)的健康和生產(chǎn)。微生物在去除有機(jī)物和氮循環(huán)、有毒硫化氫(H₂S)的產(chǎn)生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但是如果微生物對(duì)魚(yú)類(lèi)致病或發(fā)揮益生菌特性，則會(huì)直接影響魚(yú)類(lèi)的健康。
 

近日，法國(guó)Stilla公司和挪威SINTEF Ocean合作在《Journal of Microbiological Methods》雜志上發(fā)表了一篇名為“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”的文章，旨在對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。
 

在本文中，作者主要分析了與鮭魚(yú)生產(chǎn)相關(guān)的三種不同的細(xì)菌：

第一種為魚(yú)類(lèi)病原體，與魚(yú)類(lèi)的潰瘍性疾病有關(guān)的Moritella viscosa，會(huì)引起腸性紅嘴病的Yersinia ruckeri以及與魚(yú)類(lèi)的細(xì)菌性冷水病有關(guān)的Flavobacterium psychrophilum。

第二種為可以從海產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到消費(fèi)者身上的人類(lèi)病原體，Listeria monocytogenes。

第三種為通過(guò)破壞飼養(yǎng)環(huán)境威脅魚(yú)類(lèi)健康的細(xì)菌。通常硫酸鹽還原細(xì)菌（SRB）在厭氧條件下通過(guò)將硫酸鹽（SO₄^2-）轉(zhuǎn)化為有毒的硫化氫（H₂S）來(lái)影響魚(yú)類(lèi)健康�？赏ㄟ^(guò)以Desulfovibrio desulfuricans為參考菌株進(jìn)行SRB檢測(cè)。
 

研究學(xué)者利用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單重和多重檢測(cè)方式對(duì)上述優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行絕對(duì)定量。結(jié)果表明Moritella viscosa， Yersinia ruckeri，F(xiàn)lavobacterium psychrophilum檢出限在20 fg左右，Listeria monocytogenes和Desulfovibrio desulfuricans DNA檢測(cè)含量可低至2 fg，同時(shí)它們都具有較高的線性動(dòng)態(tài)范圍（圖1）。多重cdPCR檢測(cè)結(jié)果與在相應(yīng)的單重分析中檢測(cè)到的目標(biāo)基因濃度非常吻合（圖2，圖3）。此次試驗(yàn)充分證明了naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以同時(shí)精確定量復(fù)雜水質(zhì)樣品中多種優(yōu)勢(shì)菌株。
 

▲圖1 ：naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)定量5種
 

優(yōu)勢(shì)菌種的線性回歸圖，分別給出相應(yīng)的方程和回歸系數(shù)

▲圖2：對(duì)Yersinia ruckeri（A）Flavobacterium psychrophilum（B）
的單、雙重分析結(jié)果進(jìn)行比較。
 

在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加Yersinia ruckeri ，F(xiàn)lavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀釋后進(jìn)行基因拷貝數(shù)定量。

▲圖3 ：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，單重(圓形)和三重(三角形)測(cè)定的靶基因拷貝濃度繪制。

恒等線表示每個(gè)點(diǎn)的X坐標(biāo)和y坐標(biāo)相等的位置。

文章基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)完成對(duì)多種優(yōu)勢(shì)菌株的定量檢測(cè)。

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過(guò)程的耗材。樣品通過(guò)毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)微滴的形式進(jìn)入2D芯片中。3色熒光檢測(cè)儀器，整個(gè)流程只需要兩個(gè)半小時(shí)，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
 

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。