3D成像中的Cubic組織透明化
針對大組織樣本成像，由于細胞中的色素和其它成分如脂類和蛋白對光的散射和吸收，使光無法達到大樣本的深處，從而嚴重的影響了對大樣本深處結構的觀察。組織透明化技術應用水溶性有機溶劑或者親水性試劑，對固定組織通過浸泡、電泳或灌注等方式進行透化處理，然后應用高折射率介質匹配組織折射率，降低光散射，使組織達到光學透明，進而增加成像深度和圖像對比度。
Mechanisms and principles of tissue clearing technique
引自Tian T, Yang Z, Li X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 2021 Feb;238(2):489-507.
目前組織透明化方法主要有油性、基于水凝膠和水性的3種組織透明化方法。其中油性的透明化方法（包括iDisco，uDisco，3Disco，BABB和PEGASOS等方法）速度快、組織硬和易于操作，但是刺激性強、會使組織收縮、也會使熒光淬滅。基于水凝膠的透明化方法透明效率高，樣品不會收縮，但是需要專門的電泳設備，而且使用的試劑丙烯酰胺在液體狀態下有一定的致癌性。現代醫學要求理想的組織透明化方法要具有安全，操作簡單，環保，透明效率高等優點。而水性的組織透明化方法（如CUBIC, Scale和SeeDB）則生物相容性好，操作安全，具備滿足現代醫學要求的潛力。SeeDB是一種以果糖溶液作為主要透明試劑的溫和透明方法，其過程是采用梯度濃度的果糖溶液逐漸清洗生物組織樣本，直至組織變得透明，但是高濃度果糖存在黏度大、滲透性差、透明能力有限的問題。Scale法使用了以尿素為主要成分的試劑溶液，尿素可以使組織親水化，以達到減少光線散射的目的，該透明化方法透明速度較快，而且透明度較高，但是也存在生物組織膨脹、脫落、破碎等現象。CUBIC（Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis）透明化方法由Hiroki R. Ueda博士等人開發，是在Scale法的基礎上進一步發展起來的能夠做到單細胞分辨率的一種水性透明化方法，具有熒光保護、高性能及無需特殊設備等特點，該方法通過將尿素，TritonX-100,醇胺類物質按照不同比例配制的光透明化試劑對組織進行浸泡處理，可以快速、有效地使組織達到較好的透明程度。
CUBIC中的醇胺類物質能夠有效的去除樣本血紅蛋白和肌紅蛋白內的血色素，可以進一步減少光的散射和吸收，增加透明效果。CUBIC透明化方法所用到試劑主要有CUBIC-P, CUBIC-L, CUBIC-HL, CUBIC-B, CUBIC-R, CUBIC-RA。CUBIC-P，CUBIC-L, CUBIC-HL能夠對樣本進行脫脂和脫色，主要成分是N-丁基二乙醇胺和1，3-雙二氨甲基環己烷；CUBIC-B具有脫鈣的作用，主要成分是咪唑和EDTA。CUBIC-R和CUBIC-RA用于折射率匹配,主要成分是安替比林，煙酰胺或N-甲基煙酰胺，其中CUBIC-RA對熒光信號的保護能力要強于CUBIC-R。
Chemical components in CUBIC cocktails
引自Tainaka K, Murakami TC, Susaki EA, et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Rep. 2018 Aug 21;24(8):2196-2210.
為了達到更好的透明化效果，可以用不同試劑對不同的組織和器官進行透明化，大多數組織使用CUBIC-L對樣本進行透明，人體組織使用CUBIC-HL，對于骨頭等硬組織則要在CUBIC-L的基礎上使用CUBIC-B進行脫鈣處理。
CUBIC protocols using serial treatments with CUBIC cocktails
引自Tainaka K, Murakami TC, Susaki EA, et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Rep. 2018 Aug 21;24(8):2196-2210.
Ueda和他的同事在篩選了近1700種化學物質后還開發了一種稱為CUBIC-X的方法。該方法不僅可以使小鼠大腦組織像玻璃一樣透明，還可以使組織膨大為原始尺寸的10倍，讓更多的細節暴露在傳統顯微鏡下，為深入研究小鼠大腦鋪平了道路。CUBIC-X透明化方法首先對樣本進行脫脂處理，然后再利用CUBIC-X1對樣本進行膨大處理，利用CUBIC-X2進行折射率匹配，其中CUBIC-X1的主要成分是咪唑，CUBIC-X2的主要成分是咪唑和安替比林。Ueda利用CUBIC-X方法已經繪制了一張小鼠大腦圖譜。他們采用化學方法標記了大腦中的每個細胞，然后在將大腦透明化的同時將其尺寸擴大了十倍。隨后他們利用精密的成像技術對神經元進行了三維重建，據Ueda介紹，總計約7200萬個細胞。CUBIC-X具體流程見下圖。
Overview of a whole-brain expansion and hyperhydrative RI matching protocol
引自Murakami TC, Mano T, Saikawa S, et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nat Neurosci. 2018 Apr;21(4):625-637.
透明化方法可以使組織透明，但要實現組織結構的可視化，還需要合適的成像工具。近年發展起來的光片顯微鏡就是適合組織透明化成像的工具。光片顯微鏡技術改變了傳統顯微鏡光源照射方式，在同樣信噪比的情況下光片顯微鏡可以將3D成像速度提高到共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡的數十到數百倍，而光毒性減少數十至數百倍。因此光片顯微鏡技術以低光毒性、高速的三維成像優勢而被Nature Method評選為2014年的年度方法學。但是傳統光片顯微鏡存在對厘米級樣本進行微米級或更高分辨率成像時成像效率不高的問題。而平鋪光片技術作為一種新型的平面光片照明顯微技術，通過對空間光調制器加載不同的相位圖實現快速平鋪短而薄的光片，從而達到擴大視場且不影響空間分辨率和光學層析能力，可以獲取在視野范圍內各處成像分辨率均一的高分辨率圖像。锘海LS18光片顯微鏡采用了這種平鋪光片技術，克服了傳統光片顯微鏡中空間分辨率、光學層析能力和成像視野大小之間的矛盾，從而獲得均勻高分辨率的3D熒光圖像，使得3D透明化組織成像在生物醫學研究中更加可靠及可行。LS18已經在腦科學、腫瘤學、藥物研發、干細胞研究、組織胚胎學、組織病理診斷等各個領域得到了廣泛的應用。
專為透明化樣品設計的高速高分辨三維熒光顯微成像系統
參考文獻：
1. Tian T, Yang Z, Li X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 2021 Feb;238(2):489-507.
2. Tainaka K, Kubota SI, Suyama TQ, Susaki EA, Perrin D, Ukai-Tadenuma M, Ukai H, Ueda HR. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014 Nov 6;159(4):911-24.
3. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 2015 Nov;10(11):1709-27.
4. Tainaka K, Murakami TC, Susaki EA, Shimizu C, Saito R, Takahashi K, Hayashi-Takagi A, Sekiya H, Arima Y, Nojima S, Ikemura M, Ushiku T, Shimizu Y, Murakami M, Tanaka KF, Iino M, Kasai H, Sasaoka T, Kobayashi K, Miyazono K, Morii E, Isa T, Fukayama M, Kakita A, Ueda HR. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Rep. 2018 Aug 21;24(8):2196-2210.
5. Murakami TC, Mano T, Saikawa S, Horiguchi SA, Shigeta D, Baba K, Sekiya H, Shimizu Y, Tanaka KF, Kiyonari H, Iino M, Mochizuki H, Tainaka K, Ueda HR. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nat Neurosci. 2018 Apr;21(4):625-637.
