韓國浦項科技大學Sungjune Jung教授團隊使用MicroFab的按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II制備了三維（3D）肺泡屏障模型，以評估塵埃顆粒對細胞毒性、肺泡屏障結構和肺泡屏障表面活性物質分泌的生理影響，研究塵埃顆粒如何導致呼吸道疾病。全噴墨打印的肺泡屏障模型能夠高精度地模擬身體中的生理現(xiàn)象，可以用作毒理學的臨床前模型，并有助于將新發(fā)現(xiàn)轉化為有效的治療策略。

介紹

空氣中的微小塵埃顆粒通過呼吸道進入我們的身體，并導致嚴重的呼吸道疾病。因此，分析塵埃顆粒對呼吸系統(tǒng)的影響一直受到人們的極大研究興趣。目前對于塵埃顆粒進攻人體肺泡過程的研究類似于2D模型，并且在體內發(fā)生的一些現(xiàn)象是經過模擬推演的，無法準確表達其過程。Sungjune Jung教授團隊利用噴墨打印技術，通過在多孔基板上以高分辨率精確定位打印細胞，實現(xiàn)了對人體三層肺泡屏障模型的復現(xiàn)，從而在體外研究人類肺泡屏障中的塵埃顆粒毒理學。
 

▲ 圖1 研究過程示意圖。a)采用噴墨生物打印技術依次堆疊而成的肺泡屏障結構；b)肺泡屏障構建體的培養(yǎng)與成熟；c)塵埃顆粒毒理學研究。

肺泡屏障結構是通過使用MicroFab按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II逐層打印四種不同的細胞類型來制造的，如圖1所示。將NCI‐H1703, NCI‐H441, MRC5, HULEC‐5a四種細胞溶液，經過MicroFab噴墨打印系統(tǒng)精準量化打印，打印的模型具有三層結構，厚度約為10μm。通過疊層打印的方式（如圖1a），實現(xiàn)內皮細胞-基層細胞-上皮細胞的三層3D結構，再經過7天的培育（如圖1b），完全復刻人體內肺泡器官的組織結構，并使用全噴墨打印的肺泡屏障結構評估了大氣塵埃顆粒的危害。
 

▲ 圖2 塵埃濃度和暴露時間對肺泡屏障結構的活力和性能的影響。

分析用不同濃度的塵埃（0-300μg/cm²）處理不同暴露時間（1-7天）的肺泡屏障結構。為了驗證塵埃顆粒對組織增殖和代謝活性的有害影響，在每個時間點進行了CCK-8測定，如圖2a，如圖2b測量TEER，以確定暴露于塵埃后的組織屏障的完整性。圖2c根據(jù)FITC-葡聚糖通過組織屏障的量來測定屏障通透性。100和300μg/cm²組暴露于顆粒物5天，導致屏障電阻顯著降低，對4 kDa FITC‐葡聚糖的滲透性顯著增加。
 

▲ 圖3 塵埃暴露后肺泡屏障結構中的細胞調亡。

為了觀察塵埃處理的肺泡屏障結構中的細胞凋亡，進行了TUNEL測定，如圖3所示。TUNEL染色結果顯示，由于塵埃顆粒的濃度和時間依賴效應，隨著塵埃暴露時間的增加，暴露于濃度為100μg/cm²或更高的塵埃會三層結構坍塌，導致更多的細胞凋亡。

▲ 圖4 塵埃暴露7天后，肺泡屏障結構的功能表征。

暴露于塵埃后7天，進行免疫組織化學分析，以證明三層組織屏障中基底膜的結構組成，如圖4所示。圖4a研究了層粘連蛋白在基底膜中的分布，圖4b對IV型膠原進行了免疫染色，圖4c研究了上皮中ATII細胞的表面活性劑分泌功能。

▲ 圖5 肺泡屏障構建中mRNA的表達。

為了研究塵埃顆粒的影響，進行了定量PCR（qPCR）來確定與細胞外基質降解和肺功能障礙相關的mRNA表達水平。利用涉及促炎細胞因子（IL-1β和TNF-α）（圖5a、圖5b）、基質金屬蛋白酶（MMP‐1和MMP‐9）（圖5c、圖5d）、整合素亞基（ITGA1和ITGB1）（圖5e、圖5f）和肺表面活性物質蛋白（SP‐A和SP‐B）（圖5g、圖5h）的特異性標記物，通過qPCR檢測相對mRNA的表達。結果顯示，組織暴露于300μg/cm²的塵埃顆粒7天后，促炎細胞因子和MMPs的mRNA水平顯著升高。研究表明，塵埃顆粒有助于導致ECM周轉和結構變化的酶的高表達水平，相反，整合素和表面活性劑蛋白的mRNA表達水平隨著塵埃濃度和暴露時間的增加而降低。因此，塵埃顆粒會抑制肺泡組織中呼吸表面活性劑的分泌，并有可能導致表面活性劑相關的生理功能障礙。

結論
全噴墨打印的肺泡屏障結構的研究為吸入塵埃顆粒的有害影響提供了三個主要的新見解。暴露于高濃度塵埃顆粒的肺泡組織中的現(xiàn)象包括：1.促炎細胞因子的表達增加；2.組織結構的破壞和紊亂；3.與呼吸系統(tǒng)疾病相關的基因的上調或下調。全噴墨打印的肺泡屏障模型非常接近人體肺泡組織的形態(tài)、功能和微環(huán)境特征，意味著現(xiàn)代醫(yī)學可以使用全噴墨打印的方式來模仿制造人體器官可以用作毒理學的臨床前模型，并有助于將新發(fā)現(xiàn)轉化為有效的治療策略。

參考文獻：
[1] Kang, D., Lee, H., & Jung, S. (2022). Use of a 3D inkjet‐printed model to access dust particle toxicology in the human alveolar barrier. Biotechnology and Bioengineering, 119, 3668–3677.