Azure多功能分子成像系統助力揭示一種新型抗生素磷脂糖轉運抑制機制
革蘭氏陰性菌中富含脂多糖（LPS）的外膜結構對維持細胞活力至關重要，破壞外膜會增加其抗生素敏感性。外膜組裝過程中，LPS需穿過周質空間從內膜運輸至細胞表面。此過程依賴于內膜上的脂多糖轉運蛋白LptB2FGC，通過水解ATP，將LPS傳遞給由LptF、LptC、可溶性周質蛋白LptA及整合膜蛋白LptD的周質部分形成的蛋白質橋進行運輸。最近發現的大環肽家族被認為可抑制脂多糖轉運，且生化實驗顯示出對不動桿菌的抗性，但仍缺少結構信息以確定這些抗生素抑制LPS轉運的分子機制。
近日，哈佛大學在Nature雜志發表了題為“A new antibiotic traps lipopolysaccharide in its intermembrane transporter”的文章，解析了LptB2FGC復合物結合大環肽的結構，明確了LPS的轉運抑制機制，從而為下一代抗生素的開發和應用繪制了藍圖。
1 藥物與LPS的結合及結構
冷凍電鏡下，大環肽化合物1與LptB2FG和結合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達及A. baylyi 菌株表達的LptB2FGC復合物在LPS存在下結合大環肽化合物1的結構（圖1d），呈現出高度一致性。
圖1c、不動桿菌LptB2FG復合物與LPS、化合物1結合的內膜冷凍電鏡結構d，轉運體腔中不動桿菌LptB2FG與不動桿菌LPS、化合物1結合的冷凍電鏡圖（白色），與大腸桿菌LPS和1結合不動桿菌LptB2FG的結構疊加。
大環肽化合物的結合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關鍵殘基的突變會不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統成像），監測LPS從LptB2FGC復合物釋放向LPtA的轉運。結果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實了大環肽-LptFG接觸對抑制不動桿菌菌株生長的重要性。
圖2. 轉運體中化合物1與LPS結合的中間態。a，LptF與LPS及化合物1的三元復合體結構圖， c,d, 化合物1可抑制野生型LptB2FGC向LptA轉運LPS(c)，但對LptB2FE249KGC或LptB2FI317NGC 無效(d)（Azure多功能分子成像系統拍攝）。e，轉運體腔中LptB2FG結合LPS（白色）與LptB2FG-LPS-1結構的疊加圖。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結構，結果顯示其整體構象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時相同(圖2e)。表明該狀態可作為抗生素開發的藥物作用構象。此外，LptF Arg30和Arg55對不動桿菌中復合物的功能至關重要，可能有助于在運輸過程中定位LPS。
作者隨后構建了LPS的LpxM缺失突變體，探究不動桿菌LPS的結構改變對化合物1抑制效力的影響。Western Blot實驗顯示（Azure多功能分子成像系統成像），當化合物1濃度達到抑制野生型LPS運輸所需濃度的20倍時，從大腸桿菌ΔlpxM分離的LPS的運輸是可能的(圖3b)。不動桿菌ΔLpxM LPS對化合物1的易感性比野生型低30倍 ，與此結果一致。由于ΔLpxM菌株毒力較低，因此lpxM缺失可能不會導致體內大環肽的易感性降低。
圖3. 化合物1對野生型及ΔLpxM菌株的LPS轉運抑制情況。ΔLpxM菌株中分離的LPS使LptB2FGC對1具有抗性。
3 LptC螺旋與藥物的結合競爭
LptC螺旋是協調LPS運輸與ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1結構顯示，LPS轉運過程中，化合物1與LptC TM螺旋具有結合競爭。這解釋了化合物3的殺菌效力相當，但其抑制LptB2FGC復合物釋放LPS的有效性大不如1和2的原因。
冷凍電鏡顯示，化合物1和2含有相對較大的取代基，可比化合物3更有效地與LptC TM螺旋競爭。由此推斷，LptC TM螺旋缺失時，化合物1、2、3均應抑制LPS的釋放。作者隨后在體外構建轉運實驗，通過Western Blot實驗（Azure多功能分子成像系統成像）進行驗證。與預測一致，化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉運，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C對LPS的轉運方面具有同等效力(圖4d)。
圖4d, 化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉運，但1、2和3在體外抑制LptB2FG-ΔTM-C對LPS的轉運。e, 化合物 1以LPS依賴的方式增加LptB2FG、LptB2FGC和LptB2FG-ΔTM-C的ATP酶活性。f, SPA測量顯示化合物2在LPS存在而LptC不存在的情況下與Lpt結合。
4 藥物將ATP酶活性與LPS轉運分離
LptB2FG轉運體中的LPS裝載可刺激ATP酶活性。由于大環肽在轉運體中捕獲LPS，因此將化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC復合物中時，均導致ATP酶活大幅增加(圖4e) 。可見，化合物與LptB2FG的結合是大環肽發揮活性的關鍵。臨近閃爍分析(SPA)驗證了上述結論，且再次驗證了1-3均有相當的殺菌效力，以及大環肽靶與LptC TM螺旋競爭結合的作用機制。
5 總結與討論
總的來說，本研究揭示了大環肽家族的脂質轉運抑制機制，揭示了Lpt轉運體的可藥物構象，并為這類抗生素擴展到其他革蘭氏陰性病原體的應用提供了基礎。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7
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1 藥物與LPS的結合及結構
冷凍電鏡下，大環肽化合物1與LptB2FG和結合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達及A. baylyi 菌株表達的LptB2FGC復合物在LPS存在下結合大環肽化合物1的結構（圖1d），呈現出高度一致性。
大環肽化合物的結合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關鍵殘基的突變會不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統成像），監測LPS從LptB2FGC復合物釋放向LPtA的轉運。結果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實了大環肽-LptFG接觸對抑制不動桿菌菌株生長的重要性。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結構，結果顯示其整體構象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時相同(圖2e)。表明該狀態可作為抗生素開發的藥物作用構象。此外，LptF Arg30和Arg55對不動桿菌中復合物的功能至關重要，可能有助于在運輸過程中定位LPS。
作者隨后構建了LPS的LpxM缺失突變體，探究不動桿菌LPS的結構改變對化合物1抑制效力的影響。Western Blot實驗顯示（Azure多功能分子成像系統成像），當化合物1濃度達到抑制野生型LPS運輸所需濃度的20倍時，從大腸桿菌ΔlpxM分離的LPS的運輸是可能的(圖3b)。不動桿菌ΔLpxM LPS對化合物1的易感性比野生型低30倍 ，與此結果一致。由于ΔLpxM菌株毒力較低，因此lpxM缺失可能不會導致體內大環肽的易感性降低。
3 LptC螺旋與藥物的結合競爭
LptC螺旋是協調LPS運輸與ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1結構顯示，LPS轉運過程中，化合物1與LptC TM螺旋具有結合競爭。這解釋了化合物3的殺菌效力相當，但其抑制LptB2FGC復合物釋放LPS的有效性大不如1和2的原因。
冷凍電鏡顯示，化合物1和2含有相對較大的取代基，可比化合物3更有效地與LptC TM螺旋競爭。由此推斷，LptC TM螺旋缺失時，化合物1、2、3均應抑制LPS的釋放。作者隨后在體外構建轉運實驗，通過Western Blot實驗（Azure多功能分子成像系統成像）進行驗證。與預測一致，化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉運，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C對LPS的轉運方面具有同等效力(圖4d)。
4 藥物將ATP酶活性與LPS轉運分離
LptB2FG轉運體中的LPS裝載可刺激ATP酶活性。由于大環肽在轉運體中捕獲LPS，因此將化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC復合物中時，均導致ATP酶活大幅增加(圖4e) 。可見，化合物與LptB2FG的結合是大環肽發揮活性的關鍵。臨近閃爍分析(SPA)驗證了上述結論，且再次驗證了1-3均有相當的殺菌效力，以及大環肽靶與LptC TM螺旋競爭結合的作用機制。
5 總結與討論
總的來說，本研究揭示了大環肽家族的脂質轉運抑制機制，揭示了Lpt轉運體的可藥物構象，并為這類抗生素擴展到其他革蘭氏陰性病原體的應用提供了基礎。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7
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