RNA m6A甲基化修飾和特定基因m6A位點的檢測方法介紹
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物mRNA中最豐富的化學修飾，在基因表達調控中發揮著重要作用，包括轉錄調控和轉錄后調控。m6A是一種可逆修飾，分別由甲基轉移酶(writer)、去甲基化酶(eraser)和m6A結合蛋白(reader)進行添加、去除和識別。
m6A檢測技術的發展是研究m6A功能的基礎。薄層色譜（TLC）、斑點印跡（dot-blots）以及液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）是廣泛用于檢測RNA m6A整體水平變化的方法。然而這些方法無法分析m6A在轉錄組水平上的分布，也無法識別特定基因中的m6A位點。以下內容將介紹關于高通量m6A測序技術和單基因m6A位點的檢測方法。
高通量m6A測序技術
盡管對于DNA化學修飾有許多檢測方法，但開發用于RNA m6A測序方法還是存在一些困難。首先，RNA不能直接擴增，必須首先逆轉錄成cDNA。但m6A結構不影響正常堿基配對，m6A位點信息可能在逆轉錄過程中丟失。其次，盡管m6A是真核mRNA中含量最豐富的修飾，但其絕對含量非常低，并且在細胞中仍有大量的核糖體RNA（rRNA）和轉運RNA（tRNA）干擾。因此，需要通過高度特異性的方法在復雜系統中富集m6A RNA。目前已經開發出多種m6A的高通量測序技術，促進了RNA修飾的功能研究。
（1）抗體依賴性m6A測序方法
MeRIP-seq/m6A-seq 是最早使用m6A抗體開發的高通量測序技術。該技術通過mRNA片段化成100-200個核苷酸（nt），然后與m6A抗體孵育，洗脫的RNA用于構建文庫和測序。甲基化區域在免疫沉淀RNA相對于input RNA的轉錄覆蓋率稱為peaks（圖1A）。MeRIP-seq/m6A-seq 生成了約200個nt分辨率的m6A信息。MeRIP-seq/m6A-seq操作簡單，所有試劑均已商品化；因此，它一直是m6A測序的首選方法。
2021年有研究團隊開發了一種升級版的MeRIP-seq/m6A-seq方法，稱為m6A-seq2。m6A-seq2不是一次對一個樣本進行m6A免疫沉淀（m6A-IP），而是對合并RNA樣本進行m6A-IP。帶有條形碼的RNA接頭被連接到不同樣本的片段化RNA上，然后在合并樣本上執行單個抗m6A-IP，然后根據條形碼序列分配原始樣本的reads（圖1A）。m6A-seq2所有m6A-IP都在單管中進行，可以減少技術變異性、樣本起始量和文庫制備成本。此外，考慮到不同樣本之間對固定數量抗體的競爭，m6A-seq2可能能夠實現不同樣本之間m6A整體水平的比較。
m6A單堿基分辨率交聯和免疫沉淀方法（m6A-CLIP/miCLIP）可以成功生成單堿基分辨率的m6A位點信息。該方法片段化的RNA與m6A抗體孵育，然后RNA-抗體復合物通過254 nm UV光交聯，通過蛋白酶消化得到的氨基酸殘基抑制逆轉錄中的堿基配對，導致在m6A位點附近發生片段化或突變，最終以單堿基分辨率獲得m6A位點信息（圖1A）。抗體和RNA的結合效率以及交聯效率將對最終的測序結果產生重大影響。此外，交聯主要發生在抗體的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶堿基之間。因此，m6A-CLIP/miCLIP不是直接鑒定單m6A位點，而是從相鄰嘧啶位點突變中進行推斷；無法準確定位多個相鄰腺苷中的m6A，且很難對群集m6A分布進行分析。
B. 抗體非依賴性m6A測序方法示意圖：m6A SEAL-seq、m6A SAC-seq、Nanopore Direct RNA-seq和GLORI-seq。
（2）抗體非依賴性測序技術
基于抗體的m6A高通量測序技術存在明顯的缺點：m6A抗體質量不易控制，使用不同制造商的抗體獲得結果差異較大。此外，抗體的高價格和測序所需的大量RNA也阻礙其大規模應用。為了克服這些局限，科研人員也提出了多種抗體非依賴性m6A高通量測序方法。
FTO輔助的m6A選擇性化學標記方法（m6A-SEAL-seq）利用去甲基化酶FT的特性，在體外對m6A進行標記。FTO用于將m6A氧化為中間產物hm6A，hm6A進一步與二硫蘇糖醇（DTT）轉化為穩定的N6-二硫代硫醇甲基腺苷（dm6A）。然后用生物素標記dm6A以富集含有原始m6A的RNA片段。對富集的RNA進行測序以獲得m6A位點信息（圖1B）。m6A-SEAL-seq所需初始RNA量很低，FTO具有很強大的去甲基化活性，幾乎沒有序列選擇性。m6A-SEAL-seq的缺點是操作步驟多、耗時長、分辨率與MeRIP-seq相似。
選擇性丙烯基化學標記測序（m6A-SAC-seq）可以直接標記m6A，覆蓋幾乎所有m6A經典motif，并以單堿基分辨率定量分析捕獲的m6A位點。該方法使用特定酶將烯丙基化學基團添加到m6A中，形成a6m6A，經I2處理后進行環化。在逆轉錄過程中，環化的a6m6A被逆轉錄酶讀為突變。基于突變位點檢測轉錄組中的m6A位點，并通過標準曲線轉換突變率來獲得m6A含量的準確信息（圖1B）。m6A-SAC-seq可廣泛應用于各種生物學背景，并在基礎生物學研究和臨床應用中具有良好前景。m6A-SAC-seq的主要局限在于反應基于酶，因此可能具有序列偏好。
納米孔直接RNA測序（Nanopore Direct RNA-seq）是另一種能夠以單堿基分辨率鑒定m6A修飾的測序技術。當RNA通過納米孔時，通過納米孔表面的電場強度鑒定RNA序列。RNA修飾導致強度水平變化，因此可以通過以單堿基分辨率計算確定修飾堿基（圖1B）。盡管Nanopore Direct RNA-seq能夠在單堿基水平上鑒定m6A修飾，但仍存在一些缺點，如成本高、準確性低、對RNA質量和初始量要求較高。
乙二醛和亞硝酸鹽介導的未甲基化腺苷脫氨酶測序（GLORI-seq）是最近報道的技術；它能夠高效且無偏倚檢測單堿基m6A位點，并絕對定量m6A修飾水平。GLORI技術使用乙二醛和亞硝酸鹽的催化系統高效地將未甲基化腺苷脫氨形成肌苷（A到I，>98%）。肌苷在逆轉錄過程中與胞嘧啶匹配，隨后在測序過程中被讀為鳥苷（G），產生A-to-G轉化。而m6A保持不變，在測序后仍被讀為A。因此，GLORI通過檢測測序reads中A的比例，實現了對單堿基m6A的絕對定量（圖1B）。
單基因m6A位點的檢測
盡管高通量測序技術能夠快速獲得數千個m6A位點數據，但由于測序過程中的偏倚或技術原理上的缺陷，它們仍然會產生假陽性或假陰性結果。因此，有必要開發檢測單基因m6A位點的方法。
MeRIP-qRT-PCR已被廣泛用于驗證高通量測序鑒定的m6A peaks。mRNA或總RNA被片段化為100-200nt，隨后用m6A抗體進行免疫沉淀，富集的RNA通過常規qRT-PCR進行定量（圖2）。盡管MeRIP-qRT-PCR簡單實用，但它不能提供單堿基分辨率，并且依賴于m6A抗體的特異性。
基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法（SELECT）利用m6A抑制DNA聚合酶和連接酶的特性，方便快速地檢測特定位點的m6A修飾及程度。SELECT使用DNA聚合酶和連接酶連接靶位點的兩個互補DNA引物。在這個過程中，m6A首先干擾上游引物的延伸，然后阻礙下游引物的連接。盡管m6A不會100%抑制每一步，但通過兩步反應可以大幅減少最終產物量。最終，通過qRT-PCR分析目標位點和對照組的閾值循環（Ct）的差異，可以檢測目標位點的m6A修飾和甲基化程度（圖2）。SELECT操作簡便，所有實驗都可以在一個反應系統中完成，無需額外的純化步驟。但SELECT需要引入對照組并生成標準曲線以完成檢測和定量分析。
位點特異性切割和放射性標記，隨后通過連接輔助提取和TLC（SCARLET）可以以單堿基分辨率定量檢測RNA中的修飾位點，這目前是RNA修飾的“金標準”。因為RNase H會消化RNA/DNA雜交體中的RNA，但不消化RNA/2-O-甲基化DNA雜交體中的RNA，使用RNase H暴露于預定義的m6A位點進行放射性標記。使用DNA連接酶將32P標記的RNA片段連接到116個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸上。然后用RNase T1/A處理樣品以消化所有RNA，而32P標記的預定義m6A位點保持不變。經過凝膠純化和核酸酶P1消化后，通過TLC確定m6A修飾狀態（圖2）。SCARLET技術的應用受到其復雜步驟、長實驗時間和使用放射性試劑的限制。
總結而言，目前已經開發出的不同層面m6A修飾檢測方法主要有：
1）整體水平檢測：TLC、Dot-blot和LC-MS/MS；
2）轉錄組范圍內m6A修飾高通量檢測（圖1）：
a)基于特異性抗體的測序技術（MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP）；
b)非抗體依賴的測序技術（m6A-SEAL-seq、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA Seq、GLORI-Seq）；
3)單基因m6A位點檢測技術：MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET（圖2）。
以上方法有不同的應用場景，科研老師們可以根據自己的科研需求選擇適合的檢測方法。
參考文獻：
Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023 May 8;4(3):100546. pii: S2590-3462(23)00044-5. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100546. PubMed PMID: 36627844.
m6A檢測技術的發展是研究m6A功能的基礎。薄層色譜（TLC）、斑點印跡（dot-blots）以及液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）是廣泛用于檢測RNA m6A整體水平變化的方法。然而這些方法無法分析m6A在轉錄組水平上的分布，也無法識別特定基因中的m6A位點。以下內容將介紹關于高通量m6A測序技術和單基因m6A位點的檢測方法。
高通量m6A測序技術
盡管對于DNA化學修飾有許多檢測方法，但開發用于RNA m6A測序方法還是存在一些困難。首先，RNA不能直接擴增，必須首先逆轉錄成cDNA。但m6A結構不影響正常堿基配對，m6A位點信息可能在逆轉錄過程中丟失。其次，盡管m6A是真核mRNA中含量最豐富的修飾，但其絕對含量非常低，并且在細胞中仍有大量的核糖體RNA（rRNA）和轉運RNA（tRNA）干擾。因此，需要通過高度特異性的方法在復雜系統中富集m6A RNA。目前已經開發出多種m6A的高通量測序技術，促進了RNA修飾的功能研究。
（1）抗體依賴性m6A測序方法
MeRIP-seq/m6A-seq 是最早使用m6A抗體開發的高通量測序技術。該技術通過mRNA片段化成100-200個核苷酸（nt），然后與m6A抗體孵育，洗脫的RNA用于構建文庫和測序。甲基化區域在免疫沉淀RNA相對于input RNA的轉錄覆蓋率稱為peaks（圖1A）。MeRIP-seq/m6A-seq 生成了約200個nt分辨率的m6A信息。MeRIP-seq/m6A-seq操作簡單，所有試劑均已商品化；因此，它一直是m6A測序的首選方法。
2021年有研究團隊開發了一種升級版的MeRIP-seq/m6A-seq方法，稱為m6A-seq2。m6A-seq2不是一次對一個樣本進行m6A免疫沉淀（m6A-IP），而是對合并RNA樣本進行m6A-IP。帶有條形碼的RNA接頭被連接到不同樣本的片段化RNA上，然后在合并樣本上執行單個抗m6A-IP，然后根據條形碼序列分配原始樣本的reads（圖1A）。m6A-seq2所有m6A-IP都在單管中進行，可以減少技術變異性、樣本起始量和文庫制備成本。此外，考慮到不同樣本之間對固定數量抗體的競爭，m6A-seq2可能能夠實現不同樣本之間m6A整體水平的比較。
m6A單堿基分辨率交聯和免疫沉淀方法（m6A-CLIP/miCLIP）可以成功生成單堿基分辨率的m6A位點信息。該方法片段化的RNA與m6A抗體孵育，然后RNA-抗體復合物通過254 nm UV光交聯，通過蛋白酶消化得到的氨基酸殘基抑制逆轉錄中的堿基配對，導致在m6A位點附近發生片段化或突變，最終以單堿基分辨率獲得m6A位點信息（圖1A）。抗體和RNA的結合效率以及交聯效率將對最終的測序結果產生重大影響。此外，交聯主要發生在抗體的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶堿基之間。因此，m6A-CLIP/miCLIP不是直接鑒定單m6A位點，而是從相鄰嘧啶位點突變中進行推斷；無法準確定位多個相鄰腺苷中的m6A，且很難對群集m6A分布進行分析。
圖1：高通量m6A測序技術
A. 基于抗體的m6A測序方法示意圖：MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2和m6A-CLIP/miCLIP。B. 抗體非依賴性m6A測序方法示意圖：m6A SEAL-seq、m6A SAC-seq、Nanopore Direct RNA-seq和GLORI-seq。
（2）抗體非依賴性測序技術
基于抗體的m6A高通量測序技術存在明顯的缺點：m6A抗體質量不易控制，使用不同制造商的抗體獲得結果差異較大。此外，抗體的高價格和測序所需的大量RNA也阻礙其大規模應用。為了克服這些局限，科研人員也提出了多種抗體非依賴性m6A高通量測序方法。
FTO輔助的m6A選擇性化學標記方法（m6A-SEAL-seq）利用去甲基化酶FT的特性，在體外對m6A進行標記。FTO用于將m6A氧化為中間產物hm6A，hm6A進一步與二硫蘇糖醇（DTT）轉化為穩定的N6-二硫代硫醇甲基腺苷（dm6A）。然后用生物素標記dm6A以富集含有原始m6A的RNA片段。對富集的RNA進行測序以獲得m6A位點信息（圖1B）。m6A-SEAL-seq所需初始RNA量很低，FTO具有很強大的去甲基化活性，幾乎沒有序列選擇性。m6A-SEAL-seq的缺點是操作步驟多、耗時長、分辨率與MeRIP-seq相似。
選擇性丙烯基化學標記測序（m6A-SAC-seq）可以直接標記m6A，覆蓋幾乎所有m6A經典motif，并以單堿基分辨率定量分析捕獲的m6A位點。該方法使用特定酶將烯丙基化學基團添加到m6A中，形成a6m6A，經I2處理后進行環化。在逆轉錄過程中，環化的a6m6A被逆轉錄酶讀為突變。基于突變位點檢測轉錄組中的m6A位點，并通過標準曲線轉換突變率來獲得m6A含量的準確信息（圖1B）。m6A-SAC-seq可廣泛應用于各種生物學背景，并在基礎生物學研究和臨床應用中具有良好前景。m6A-SAC-seq的主要局限在于反應基于酶，因此可能具有序列偏好。
納米孔直接RNA測序（Nanopore Direct RNA-seq）是另一種能夠以單堿基分辨率鑒定m6A修飾的測序技術。當RNA通過納米孔時，通過納米孔表面的電場強度鑒定RNA序列。RNA修飾導致強度水平變化，因此可以通過以單堿基分辨率計算確定修飾堿基（圖1B）。盡管Nanopore Direct RNA-seq能夠在單堿基水平上鑒定m6A修飾，但仍存在一些缺點，如成本高、準確性低、對RNA質量和初始量要求較高。
乙二醛和亞硝酸鹽介導的未甲基化腺苷脫氨酶測序（GLORI-seq）是最近報道的技術；它能夠高效且無偏倚檢測單堿基m6A位點，并絕對定量m6A修飾水平。GLORI技術使用乙二醛和亞硝酸鹽的催化系統高效地將未甲基化腺苷脫氨形成肌苷（A到I，>98%）。肌苷在逆轉錄過程中與胞嘧啶匹配，隨后在測序過程中被讀為鳥苷（G），產生A-to-G轉化。而m6A保持不變，在測序后仍被讀為A。因此，GLORI通過檢測測序reads中A的比例，實現了對單堿基m6A的絕對定量（圖1B）。
單基因m6A位點的檢測
盡管高通量測序技術能夠快速獲得數千個m6A位點數據，但由于測序過程中的偏倚或技術原理上的缺陷，它們仍然會產生假陽性或假陰性結果。因此，有必要開發檢測單基因m6A位點的方法。
MeRIP-qRT-PCR已被廣泛用于驗證高通量測序鑒定的m6A peaks。mRNA或總RNA被片段化為100-200nt，隨后用m6A抗體進行免疫沉淀，富集的RNA通過常規qRT-PCR進行定量（圖2）。盡管MeRIP-qRT-PCR簡單實用，但它不能提供單堿基分辨率，并且依賴于m6A抗體的特異性。
基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法（SELECT）利用m6A抑制DNA聚合酶和連接酶的特性，方便快速地檢測特定位點的m6A修飾及程度。SELECT使用DNA聚合酶和連接酶連接靶位點的兩個互補DNA引物。在這個過程中，m6A首先干擾上游引物的延伸，然后阻礙下游引物的連接。盡管m6A不會100%抑制每一步，但通過兩步反應可以大幅減少最終產物量。最終，通過qRT-PCR分析目標位點和對照組的閾值循環（Ct）的差異，可以檢測目標位點的m6A修飾和甲基化程度（圖2）。SELECT操作簡便，所有實驗都可以在一個反應系統中完成，無需額外的純化步驟。但SELECT需要引入對照組并生成標準曲線以完成檢測和定量分析。
位點特異性切割和放射性標記，隨后通過連接輔助提取和TLC（SCARLET）可以以單堿基分辨率定量檢測RNA中的修飾位點，這目前是RNA修飾的“金標準”。因為RNase H會消化RNA/DNA雜交體中的RNA，但不消化RNA/2-O-甲基化DNA雜交體中的RNA，使用RNase H暴露于預定義的m6A位點進行放射性標記。使用DNA連接酶將32P標記的RNA片段連接到116個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸上。然后用RNase T1/A處理樣品以消化所有RNA，而32P標記的預定義m6A位點保持不變。經過凝膠純化和核酸酶P1消化后，通過TLC確定m6A修飾狀態（圖2）。SCARLET技術的應用受到其復雜步驟、長實驗時間和使用放射性試劑的限制。
圖2：單基因m6A位點檢測方法
位點特異性m6A檢測方法示意圖：MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET。總結而言，目前已經開發出的不同層面m6A修飾檢測方法主要有：
1）整體水平檢測：TLC、Dot-blot和LC-MS/MS；
2）轉錄組范圍內m6A修飾高通量檢測（圖1）：
a)基于特異性抗體的測序技術（MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP）；
b)非抗體依賴的測序技術（m6A-SEAL-seq、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA Seq、GLORI-Seq）；
3)單基因m6A位點檢測技術：MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET（圖2）。
以上方法有不同的應用場景，科研老師們可以根據自己的科研需求選擇適合的檢測方法。
參考文獻：
Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023 May 8;4(3):100546. pii: S2590-3462(23)00044-5. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100546. PubMed PMID: 36627844.
標簽：
RNA甲基化
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