Cas9輔助靶向測序檢測林奇綜合征PMS2的大片段倒位現(xiàn)象
SageHLS+Illumina：Cas9輔助靶向測序檢測林奇綜合征相關(guān)基因PMS2的大片段倒位現(xiàn)象
- 背景知識：
林奇綜合征（Lynch Syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳疾病，會導(dǎo)致直腸癌或其他部位罹患惡性腫瘤，約3%結(jié)直腸癌由LS引起，是最常見的遺傳性結(jié)直腸癌綜合征。
林奇綜合癥是因為錯配修復(fù)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等）的胚系突變所誘發(fā)的。已有研究表明7號染色體上錯配修復(fù)基因PMS2（band p22.1，如圖1）的破壞性突變與兩種遺傳性癌癥綜合征有關(guān)：體質(zhì)性錯配修復(fù)缺陷（CMMRD）和林奇綜合征（LS）。7號染色體上存在有15個PMS2假基因和覆蓋PMS2基因3'部分（外顯子9-15區(qū)域）的100kb低拷貝數(shù)重復(fù)序列（LCR，又稱節(jié)段重復(fù)）。同時，反向LCR序列的第二個拷貝位于離著絲粒700kb的位置，與端粒拷貝（包含PMS2CL假基因）具有95%以上的同源性。雖然LCR間的倒位現(xiàn)象會導(dǎo)致PMS2基因活化突變，但因LCR之間相隔很遠且序列同源性高，已有NGS測序方法無法對這種復(fù)雜的情況實現(xiàn)檢測，亟需新的技術(shù)或方法對相關(guān)基因的大結(jié)構(gòu)變異進行精準研究。
林奇綜合癥是因為錯配修復(fù)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等）的胚系突變所誘發(fā)的。已有研究表明7號染色體上錯配修復(fù)基因PMS2（band p22.1，如圖1）的破壞性突變與兩種遺傳性癌癥綜合征有關(guān)：體質(zhì)性錯配修復(fù)缺陷（CMMRD）和林奇綜合征（LS）。7號染色體上存在有15個PMS2假基因和覆蓋PMS2基因3'部分（外顯子9-15區(qū)域）的100kb低拷貝數(shù)重復(fù)序列（LCR，又稱節(jié)段重復(fù)）。同時，反向LCR序列的第二個拷貝位于離著絲粒700kb的位置，與端粒拷貝（包含PMS2CL假基因）具有95%以上的同源性。雖然LCR間的倒位現(xiàn)象會導(dǎo)致PMS2基因活化突變，但因LCR之間相隔很遠且序列同源性高，已有NGS測序方法無法對這種復(fù)雜的情況實現(xiàn)檢測，亟需新的技術(shù)或方法對相關(guān)基因的大結(jié)構(gòu)變異進行精準研究。
圖1.hg38參考基因組中PMS2基因位置圖
- HLS-Cas9輔助靶向測序?qū)嶒灧椒ǎ?/strong>
利用來自the Ashkenazi trio（HG002、HG003、HG004）的Coriell細胞系樣本，研究人員在體外用Cas9核酸內(nèi)切酶靶向選擇切割200kb的基因組DNA片段，并通過HLS-CATCH技術(shù)平臺進行超長DNA片段回收。回收得到的200kb DNA片段，既橫跨整個端粒LCR加上LCR兩側(cè)約50kb的獨特側(cè)翼序列，又包含整個未重排的PMS2基因，因此能夠完成PMS2基因座的短讀長測序，同時不會引起著絲粒LCR或PMS2假基因的并發(fā)問題。為了測試涉及LCR區(qū)域的倒位現(xiàn)象，使用不同的Cas9切割端粒LCR外的相同端粒近端位點，以及在著絲粒LCR內(nèi)部約50kb的獨特序列中的第二切割位點。第二次Cas9切割也將從倒位等位基因中釋放出200kb長片段，測序reads與未重排等位基因不同的模式進行拼接，其中第二切割位點和著絲粒LCR邊界之間的區(qū)域覆蓋率很高，該區(qū)域距離未重排的PMS2基因的位置約650kb。
HLS-CATCH技術(shù)平臺，是Sage Science 公司開發(fā)的SageHLS超長DNA片段回收儀結(jié)合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）技術(shù)構(gòu)成。首先，將核酸裝載到Sage HLS預(yù)制膠樣品孔中進行電泳，完整的染色體DNA被截留在樣品孔中；關(guān)閉電泳并加入用于切除大部分PMS2區(qū)域的Cas9復(fù)合物(如圖2所示)；最后，消化產(chǎn)物通過儀器自帶的脈沖場電泳實現(xiàn)純化回收。繼而qPCR定性定量檢測回收產(chǎn)物，隨后在Illumina測序儀上進行測序分析，測序分析結(jié)果見圖3。
HLS-CATCH技術(shù)平臺，是Sage Science 公司開發(fā)的SageHLS超長DNA片段回收儀結(jié)合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）技術(shù)構(gòu)成。首先，將核酸裝載到Sage HLS預(yù)制膠樣品孔中進行電泳，完整的染色體DNA被截留在樣品孔中；關(guān)閉電泳并加入用于切除大部分PMS2區(qū)域的Cas9復(fù)合物(如圖2所示)；最后，消化產(chǎn)物通過儀器自帶的脈沖場電泳實現(xiàn)純化回收。繼而qPCR定性定量檢測回收產(chǎn)物，隨后在Illumina測序儀上進行測序分析，測序分析結(jié)果見圖3。
圖2. HLS-CATCH技術(shù)平臺
圖3.目標片段測序覆蓋情況
在基因組分析中，檢測長片段的倒位仍然是一個難題，其他方法如Strand-seq（Falconer等人，2012）、超長納米孔測序（Zhou等人，2020）和熒光標測技術(shù)（Lam等人，2012年），都需要專門的DNA提取和處理步驟。本應(yīng)用中基于HLS-CATCH技術(shù)（SageHLS超長DNA片段回收儀結(jié)合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）），從細胞核（或細胞）中提取HMW DNA到Cas9酶切步驟全程自動化完成。酶切產(chǎn)物的片段大小直接從HLS-CATCH洗脫回收。鑒于短讀長Illumina測序成功獲取檢測目標片段的詳細情況，該方法也適用于其他由染色體重排、倒位、易位現(xiàn)象導(dǎo)致的疾病研究等。定制化基因組切割、片段大小篩選和短讀長Illumina測序的高覆蓋率分析運用，使其成為一種相對簡單且具有成本效益的大片段倒位分析方法。
- NOTE：
Detection of large inversions involving the Lynch syndrome genePMS2 using Cas9-assisted targeted sequencing. Chris Boles,Tina Huang, Feng Chen, Sage Science, Inc., Beverly, MA.,Illumina, Inc., Foster City, CA.
美國Sage Science是全球領(lǐng)先的全自動DNA脈沖場電泳回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國技術(shù)專利，各個型號產(chǎn)品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。
環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區(qū)的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產(chǎn)品線引入國內(nèi)，一直為國內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收儀的安裝測試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。
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