免疫沉淀（IP）與酸洗脫（MAE）分離方法免疫肽結果的比較詳解
主要組織相容性復合體(MHC)負責在細胞表面呈遞數千種肽，這些MHC結合肽(MBP)不僅在適應性免疫的功能研究中發揮作用，而且是可用于癌癥免疫治療的新抗原的來源，如疫苗或細胞療法。近年來，質譜技術的發展使直接檢測MHC在細胞表面呈現的MBP成為可能，為快速準確地鑒定免疫肽提供了一種新的工具。如圖1所示，首先通過泛MHC免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細胞系中分離MHC復合物，隨后進行洗脫以去除未特異性結合的肽段，然后使用酸性洗脫緩沖液將結合的抗原肽從MHC分子和抗體上解離，洗脫后的肽段進行質譜檢測，用于免疫肽組檢測和新抗原的發現。
圖1. 基于質譜技術對腫瘤患者免疫肽譜分析的工作流程[1]
溫和酸洗脫（MAE）是另一種分離MHC和抗原肽的策略，可以在短時期內直接從細胞膜中洗脫MHC肽段，在低pH的溫和酸性條件下改變MHC-I（β2-微球蛋白）的空間結構，從而釋放結合的肽段。MAE的主要缺點是非特異結合肽的比例較高，這增加了假陽性的數量并降低了該方法的特異性。通常，MHC-IP方法鑒定的肽段數量和特異性高于MAE的結果。
圖2. MHC與肽段復合物的分離方法：酸洗脫（MAE）和免疫沉淀（IP）[2]
自20世紀90年代初，通過質譜鑒定MHC免疫肽已經為MHC分子全局抗原呈遞的特性提供了深入的見解，也是MHC和抗原肽特異性結合模式最強有力的證據之一，Zhang X等研究人員總結了從1990年到2019年發表的40篇基于質譜技術的MHC免疫肽組相關的文獻（表1）。與MAE（溫和酸洗脫）相比，IP（免疫沉淀）已成為主要的抗原肽分離方法。DDA（數據依賴采集）是最廣泛使用的免疫肽檢測的方法。靶向SRM/PRM（選擇反應監測/并行反應監測）方法主要用于少量抗原肽的驗證或絕對定量。盡管DIA（數據獨立采集）已被證明比DDA具有更深的肽段的覆蓋，但由于DIA數據解釋的復雜性，DIA仍未成為免疫肽檢測的主要方法。
表1. 基于質譜技術MHC免疫肽相關文獻的總結[3]
我們對免疫沉淀(IP)和酸洗脫(MAE)的分離方法進行了對比，結果如圖3所示[4]。活細胞（living cell）IP免疫肽鑒定的結果是MAE鑒定結果的3倍以上，而且IP 鑒定到免疫肽的類型能夠覆蓋大多數MAE和MAE-IP免疫肽的類型（~75%）。此外，MAE鑒定結果中有結合肽段的比例明顯低于IP的結果，特別是凍存細胞，MAE鑒定到更多的非特異性結合的肽段，污染物肽的比例較高。
圖3.免疫沉淀(IP)和酸洗脫(MAE)免疫肽鑒定結果比較。
A. 免疫肽鑒定數目；B. 免疫肽的結合情況；C.有結合免疫肽的重疊率。
A. 免疫肽鑒定數目；B. 免疫肽的結合情況；C.有結合免疫肽的重疊率。
總的來說，免疫沉淀IP的分離方法，適合所有的樣本類型，如組織或細胞樣本，而且免疫肽鑒定深度高且特異性強。MAE的分離方法僅對細胞樣本比較適用，特別是活細胞的樣本，在凍存的細胞類型上效果更差。
參考文獻:
[1]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.
[2]Kote, Sachin, et al. Mass spectrometry-based identification of MHC-associated peptides. Cancers, 2020
[3]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.
[4]Distinguishing MIP Profiling by MS with immunoprecipitation and Mild Acid Elution methods. P. Wu., H. Miao., et. al. TP 576, 72nd ASMS Conference, Anaheim, California, 2024
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