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PCR進階:GC-Rich片段的擴增策略詳解

瀏覽次數:2050 發布日期:2024-9-23  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

前言

PCR擴增不出來條帶的原因有很多,諸如引物設計有誤,DNA模板已降解,酶失活或者有雜酶污染,緩沖液條件不當,模板DNA的GC含量太高等等。大部分原因可以通過換試劑得到解決,但是對于高GC含量的樣本,擴增起來始終是有難度。

模板GC含量高就難以擴增的原因在于G、C之間形成三對氫鍵,解鏈所需能量較高,故模板較難打開,在常規變性溫度下,DNA模板變性不完全,同時由于單鏈的G+C豐富區易于自身互補配對形成穩定的發夾環二級結構,而使PCR引物難以結合到模板上。

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目前,研究學者建立了各種不同的方法來解決高GC含量DNA模板擴增困難的問題。常用的方法包括:

1、添加增強劑,如甘油、DMSO等,有助于打開復雜二級結構;

2、提高變性溫度,比如96度5分鐘然后再加熱啟動酶;

3、降落PCR,在PCR循環過程中逐步降低退火溫度,從而在初始階段提高退火溫度, 減少非特異性結合,提高特異性擴增;

4、提高PCR擴增儀的瞬時功率,利用更大的能量打開DNA的二級結構,從而提高PCR反應的效率‌。

PCR技術不斷發展, 高功率PCR擴增儀已作為一項新型技術,逐漸被應用于解決GC含量高的DNA模板擴增難題。這種儀器通過提供更強的熱循環能力,能夠有效地打開DNA的二級結構,特別適合于高GC含量的樣本擴增。

艾普拜生物重磅推出精衛自動PCR儀, 瞬時功率可達750W, 不僅提高了復雜樣本擴增實驗的成功率,還大大縮短了實驗時間,為研究人員提供了強而有力的科研工具。

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精衛自動PCR儀的優勢:

1、更高效的熱循環: 高功率可以減少達到變性溫度所需的時間,使模板能夠充分變性,為后續的引物結合和延伸步驟創造良好條件。

2、均勻的熱傳遞: 高功率 PCR 儀能夠提供更均勻的加熱,避免部分模板無法完全變性或引物結合不充分導致擴增不成功,提高反應的穩定性和重復性。

3、適應高難度的PCR反應: 在一些特殊的 PCR 應用中,如長片段DNA 、高 GC 含量的樣本擴增、復雜二級結構等。

4、減少溫度波動: 對于高 GC 含量的模板,溫度的微小波動可能會影響 DNA 雙鏈的穩定性和引物的結合效率,高功率 PCR 儀可以更好地維持溫度的穩定性,保證高 GC 片段的順利擴增。

應用案例:

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儀器:Kingwell 96,高GC含量,反應體系:10ul

發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
聯系電話:0512--86860010
E-mail:info@aperbio.com

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