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Western Blot實驗進階——提升磷酸化蛋白WB檢測成功率的方法

瀏覽次數:876 發布日期:2025-2-13  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

磷酸化蛋白作為細胞信號轉導的關鍵調控者,其研究對揭示生命奧秘和疾病機制至關重要。然而,磷酸化蛋白的低豐度和動態變化特性,WB顯影成像時常常會碰到以下問題:

  • 條帶微弱
  • 無條帶
  • 高背景、雜帶多等 

本文整理了磷酸化蛋白Western Blot 實驗的優化建議,以幫助研究人員提升實驗成功率。 

什么是磷酸化蛋白?
磷酸化蛋白是指蛋白質在激酶催化下發生磷酸化修飾的一類蛋白質。這種修飾如同一個“開關”,調控著蛋白質的活性、定位和相互作用,進而影響細胞增殖、分化、代謝等幾乎所有生命活動。

磷酸化蛋白的研究意義?
磷酸化蛋白的研究廣泛,涉及以下領域:
細胞信號通路:研究細胞如何通過磷酸化響應外界刺激。
* 疾病機磷酸化異常與多種疾病相關,如癌癥、神經退行性疾病和糖尿病。
藥物開發磷酸化蛋白是重要的藥物靶點,研究其調控機制有助于開發新藥。

如何做好磷酸化蛋白WB檢測?
為了提升Western Blot檢測磷酸化蛋白的成功率,我們建議從以下幾方面著手優化:

1通過有效的樣本制備提高目的蛋白豐度
制備優質的蛋白質樣品是WB 實驗的起點,特別是針對低豐度蛋白如磷酸化蛋白、膜蛋白、核蛋白等,建議根據蛋白定位,使用特定的蛋白提取方法對目的蛋白進行富集。選擇錯誤的裂解液會造成樣品中無目的蛋白的情況,例如目的蛋白為核蛋白時請勿使用NP-40這類溫和的裂解液。

2、有效分離蛋白樣品,提高蛋白轉印到膜上的效率
為了避免蛋白電泳過程中被降解,選擇合適的膠和電泳緩沖液非常重要。中性pH加上溫和的樣本制備方案,可以讓蛋白樣品始終處于溫和的非酸性條件下,從而保留了完整性并最大程度地減少了蛋白修飾,所以更適用于低豐度蛋白的分離。

經電泳分離的蛋白需要轉印到膜材質表面,以便后續抗體能與目的蛋白結合、檢測。轉印膜要求柔韌易裁剪,耐化學試劑處理,當然最重要的是蛋白載量高,以盡可能提高低豐度蛋白的檢測成功率。相對于NC膜,PVDF膜性能優越,是公認的WB專用膜。膜上沒有蛋白樣品的區域,須用合適的試劑進行封閉,以減少抗體結合到膜上形成高背景。

3選擇優質抗體
抗體優選是低豐度WB檢測的關鍵一環,好的抗體具有高親和性、高特異性等特點。需注意抗體濃度高并不代表結果好,合理的一抗、二抗以及樣品濃度才能保證良好的ECL顯色。此外,有些情況下可以選擇多克隆抗體,能識別多個表位、提高檢測的靈敏度,對于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。

4、選擇高靈敏度ECL發光液
做WB實驗時,ECL發光液對于實驗的成功非常重要,用高靈敏度ECL發光液不僅可曝光得到漂亮的目的條帶,還可以節約時間,以及節約昂貴的抗體成本。

5選擇高靈敏度、寬定量范圍成像系統
低豐度蛋白檢測,需要寬定量范圍的成像方式,這樣才能獲取更好的數據,更有利于下一步半定量分析。

ChemiScope S7 一體式超高靈敏化學發光成像儀是一款高性能、智能化的化學發光成像儀,采用光子無損式成像技術將樣品直接與感光芯片接觸,無需鏡頭,極大程度減少光信號損失,提供無與倫比的高靈敏度和低噪聲、寬動態范圍圖像,讓您可以同時捕獲強、弱蛋白信號,所有目標條帶都清晰可見,且背景干凈。

產品特點:
● 169cm²超大感光面積、印跡膜貼合感光芯片成像 
對比傳統CCD相機,ChemiScope S7將檢測靈敏度和定量范圍提升2個數量級
● 彩色Marker
更有助于判定目的條帶的分子量
● 智能化操作
進倉自動拍攝彩色Marker和化學發光圖像,并自動疊加
● 一體式設計,機身小巧
內置10.1英寸觸摸屏,無需外接電腦

如有興趣產品試用, 歡迎聯系勤翔市場部:17302194527【微信同號】

發布者:上海勤翔科學儀器有限公司
聯系電話:021-65332202
E-mail:info@clinx.cn

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