人源Fab抗體庫構(gòu)建及抗流感病毒抗體篩選與特性分析
摘要
通過采集健康志愿者外周血，分離B細(xì)胞并提取mRNA，構(gòu)建人源Fab抗體庫。利用噬菌體展示技術(shù)篩選針對流感病毒H1N1和H3N2亞型的特異性抗體，結(jié)合ELISA、假病毒中和實驗及表面等離子共振技術(shù)對抗體親和力及中和活性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，成功篩選出3株高親和力（KD < 10 nM）及廣譜中和活性抗體，為流感治療提供潛在候選分子。
引言
流感病毒因其高突變率和抗原漂移特性，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗及單抗藥物易失效。目前臨床應(yīng)用的抗流感抗體多靶向血凝素（HA）保守區(qū)域，但存在廣譜性不足或親和力低等問題。基于噬菌體展示技術(shù)的人源抗體庫篩選策略，可直接從天然免疫庫中挖掘高活性抗體，具有高效、多樣化的優(yōu)勢。通過構(gòu)建大容量人源Fab抗體庫（>1×10^9），結(jié)合多輪生物淘選技術(shù)，篩選出靶向HA蛋白的廣譜中和抗體，并系統(tǒng)評估其結(jié)合特性與功能活性，為流感抗體藥物開發(fā)提供新思路。
實驗部分
1. 人源Fab抗體庫構(gòu)建
1.1 外周血單核細(xì)胞分離與RNA提取
采集5名健康志愿者外周血（經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)），使用某試劑密度梯度離心法分離PBMC。總RNA提取采用某試劑TRIzol法，純度（A260/A280）>1.8，濃度>500 ng/μL。
1.2 Fab基因擴(kuò)增與載體構(gòu)建
通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增抗體輕鏈（κ/λ）及重鏈Fd段基因。采用重疊延伸PCR（SOE-PCR）將輕鏈與重鏈連接為Fab片段，克隆至噬菌體展示載體pComb3X。載體線性化使用威尼德分子雜交儀完成。
1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化與庫容量評估
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL1-Blue大腸桿菌，使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：2.5 kV，5 ms）。最終庫容量達(dá)3.2×10^9 CFU，隨機(jī)挑取50個克隆經(jīng)酶切驗證，陽性率>90%。
2. 抗流感病毒抗體篩選
2.1 抗原包被與生物淘選
重組表達(dá)H1N1（A/California/07/2009）及H3N2（A/Hong Kong/4801/2014）的HA蛋白，固定于免疫管進(jìn)行3輪淘選。每輪洗脫條件逐步嚴(yán)格（PBS-Tween 20濃度從0.1%增至0.5%）。
2.2 噬菌體擴(kuò)增與富集分析
使用威尼德紫外交聯(lián)儀輔助噬菌體擴(kuò)增，第三輪富集后噬菌體滴度提升至1×10^7 pfu/mL。通過ELISA檢測富集效果，陽性克隆比例從0.5%升至62%。
3. 抗體特性分析
3.1 親和力測定
采用表面等離子共振（SPR，某品牌儀器）檢測抗體與HA結(jié)合動力學(xué)。固定HA至CM5芯片，抗體濃度梯度為0.78-100 nM。擬合結(jié)果顯示，抗體FAB-09對H1N1的KD值為2.3 nM，對H3N2的KD值為5.8 nM。
3.2 假病毒中和實驗
構(gòu)建攜帶HA基因的HIV-1假病毒系統(tǒng)，檢測抗體中和活性。FAB-09對H1N1和H3N2的IC50分別為0.15 μg/mL和0.38 μg/mL，顯著優(yōu)于對照抗體CR6261（IC50=0.9 μg/mL）。
3.3 表位競爭分析
采用競爭ELISA法，證實FAB-09與CR6261結(jié)合HA表位區(qū)域部分重疊，但其結(jié)合構(gòu)象更偏向HA莖部保守區(qū)。
4. 抗體穩(wěn)定性評估
4.1 熱穩(wěn)定性實驗
使用差示掃描熒光法（DSF）測定抗體Tm值。FAB-09在pH 7.4緩沖液中Tm為68.5°C，高于人IgG1平均Tm值（62°C）。
4.2 長期儲存穩(wěn)定性
將抗體溶液（1 mg/mL）于4°C保存4周，經(jīng)SDS-PAGE及SEC-HPLC分析，單體含量維持>95%，無顯著聚集。
結(jié)果與討論
研究成功構(gòu)建庫容量達(dá)3.2×10^9的人源Fab抗體庫，篩選獲得3株具有交叉中和活性的抗體。其中FAB-09展現(xiàn)出對H1N1和H3N2亞型的廣譜中和能力，其結(jié)合表位位于HA保守區(qū)域，且熱穩(wěn)定性優(yōu)異。與傳統(tǒng)鼠源抗體相比，人源Fab抗體免疫原性風(fēng)險更低，更適用于臨床開發(fā)。
值得注意的是，威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率（>1×10^10 CFU/μg DNA）及紫外交聯(lián)儀的精準(zhǔn)控溫功能，為抗體庫構(gòu)建質(zhì)量提供了關(guān)鍵保障。后續(xù)研究將進(jìn)一步通過動物模型驗證抗體體內(nèi)保護(hù)效果，并優(yōu)化其成藥性。
結(jié)論
研究建立了一套高效的人源Fab抗體庫構(gòu)建與篩選平臺，所獲抗體FAB-09兼具高親和力、廣譜中和活性及良好穩(wěn)定性，為流感病毒治療提供了新的候選分子。該技術(shù)體系亦可拓展至其他病原體抗體的快速開發(fā)。
參考文獻(xiàn)
1. 王輝;王琰;沈倍奮;抗體庫技術(shù)中輔助噬菌體的研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2008年02期
2. Generation and selection of immunized Fab phage display library against human B cell lymphoma[J];Cell Research;2007年07期
3. 閉蘭;余模松;抗體工程研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2006年01期
4. 高榮凱;王琰;琥珀突變型輔助病毒VCSM13N1的構(gòu)建[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年12期
5. 戴和平,高宏,趙新顏噬菌體展示技術(shù)的原理和方法[J];水生生物學(xué)報;2002年04期
6. 王希良,黃云輝,朱錫華噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)在人抗體庫中的研究策略[J];免疫學(xué)雜志;2000年04期
通過采集健康志愿者外周血，分離B細(xì)胞并提取mRNA，構(gòu)建人源Fab抗體庫。利用噬菌體展示技術(shù)篩選針對流感病毒H1N1和H3N2亞型的特異性抗體，結(jié)合ELISA、假病毒中和實驗及表面等離子共振技術(shù)對抗體親和力及中和活性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，成功篩選出3株高親和力（KD < 10 nM）及廣譜中和活性抗體，為流感治療提供潛在候選分子。
引言
流感病毒因其高突變率和抗原漂移特性，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗及單抗藥物易失效。目前臨床應(yīng)用的抗流感抗體多靶向血凝素（HA）保守區(qū)域，但存在廣譜性不足或親和力低等問題。基于噬菌體展示技術(shù)的人源抗體庫篩選策略，可直接從天然免疫庫中挖掘高活性抗體，具有高效、多樣化的優(yōu)勢。通過構(gòu)建大容量人源Fab抗體庫（>1×10^9），結(jié)合多輪生物淘選技術(shù)，篩選出靶向HA蛋白的廣譜中和抗體，并系統(tǒng)評估其結(jié)合特性與功能活性，為流感抗體藥物開發(fā)提供新思路。
實驗部分
1. 人源Fab抗體庫構(gòu)建
1.1 外周血單核細(xì)胞分離與RNA提取
采集5名健康志愿者外周血（經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)），使用某試劑密度梯度離心法分離PBMC。總RNA提取采用某試劑TRIzol法，純度（A260/A280）>1.8，濃度>500 ng/μL。
1.2 Fab基因擴(kuò)增與載體構(gòu)建
通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增抗體輕鏈（κ/λ）及重鏈Fd段基因。采用重疊延伸PCR（SOE-PCR）將輕鏈與重鏈連接為Fab片段，克隆至噬菌體展示載體pComb3X。載體線性化使用威尼德分子雜交儀完成。
1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化與庫容量評估
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL1-Blue大腸桿菌，使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：2.5 kV，5 ms）。最終庫容量達(dá)3.2×10^9 CFU，隨機(jī)挑取50個克隆經(jīng)酶切驗證，陽性率>90%。
2. 抗流感病毒抗體篩選
2.1 抗原包被與生物淘選
重組表達(dá)H1N1（A/California/07/2009）及H3N2（A/Hong Kong/4801/2014）的HA蛋白，固定于免疫管進(jìn)行3輪淘選。每輪洗脫條件逐步嚴(yán)格（PBS-Tween 20濃度從0.1%增至0.5%）。
2.2 噬菌體擴(kuò)增與富集分析
使用威尼德紫外交聯(lián)儀輔助噬菌體擴(kuò)增，第三輪富集后噬菌體滴度提升至1×10^7 pfu/mL。通過ELISA檢測富集效果，陽性克隆比例從0.5%升至62%。
3. 抗體特性分析
3.1 親和力測定
采用表面等離子共振（SPR，某品牌儀器）檢測抗體與HA結(jié)合動力學(xué)。固定HA至CM5芯片，抗體濃度梯度為0.78-100 nM。擬合結(jié)果顯示，抗體FAB-09對H1N1的KD值為2.3 nM，對H3N2的KD值為5.8 nM。
3.2 假病毒中和實驗
構(gòu)建攜帶HA基因的HIV-1假病毒系統(tǒng)，檢測抗體中和活性。FAB-09對H1N1和H3N2的IC50分別為0.15 μg/mL和0.38 μg/mL，顯著優(yōu)于對照抗體CR6261（IC50=0.9 μg/mL）。
3.3 表位競爭分析
采用競爭ELISA法，證實FAB-09與CR6261結(jié)合HA表位區(qū)域部分重疊，但其結(jié)合構(gòu)象更偏向HA莖部保守區(qū)。
4. 抗體穩(wěn)定性評估
4.1 熱穩(wěn)定性實驗
使用差示掃描熒光法（DSF）測定抗體Tm值。FAB-09在pH 7.4緩沖液中Tm為68.5°C，高于人IgG1平均Tm值（62°C）。
4.2 長期儲存穩(wěn)定性
將抗體溶液（1 mg/mL）于4°C保存4周，經(jīng)SDS-PAGE及SEC-HPLC分析，單體含量維持>95%，無顯著聚集。
結(jié)果與討論
研究成功構(gòu)建庫容量達(dá)3.2×10^9的人源Fab抗體庫，篩選獲得3株具有交叉中和活性的抗體。其中FAB-09展現(xiàn)出對H1N1和H3N2亞型的廣譜中和能力，其結(jié)合表位位于HA保守區(qū)域，且熱穩(wěn)定性優(yōu)異。與傳統(tǒng)鼠源抗體相比，人源Fab抗體免疫原性風(fēng)險更低，更適用于臨床開發(fā)。
值得注意的是，威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率（>1×10^10 CFU/μg DNA）及紫外交聯(lián)儀的精準(zhǔn)控溫功能，為抗體庫構(gòu)建質(zhì)量提供了關(guān)鍵保障。后續(xù)研究將進(jìn)一步通過動物模型驗證抗體體內(nèi)保護(hù)效果，并優(yōu)化其成藥性。
結(jié)論
研究建立了一套高效的人源Fab抗體庫構(gòu)建與篩選平臺，所獲抗體FAB-09兼具高親和力、廣譜中和活性及良好穩(wěn)定性，為流感病毒治療提供了新的候選分子。該技術(shù)體系亦可拓展至其他病原體抗體的快速開發(fā)。
參考文獻(xiàn)
1. 王輝;王琰;沈倍奮;抗體庫技術(shù)中輔助噬菌體的研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2008年02期
2. Generation and selection of immunized Fab phage display library against human B cell lymphoma[J];Cell Research;2007年07期
3. 閉蘭;余模松;抗體工程研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2006年01期
4. 高榮凱;王琰;琥珀突變型輔助病毒VCSM13N1的構(gòu)建[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年12期
5. 戴和平,高宏,趙新顏噬菌體展示技術(shù)的原理和方法[J];水生生物學(xué)報;2002年04期
6. 王希良,黃云輝,朱錫華噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)在人抗體庫中的研究策略[J];免疫學(xué)雜志;2000年04期
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