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鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序

鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序


Strand-specific RNA sequencing
鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序（strand-specific RNA sequencing）是指在構(gòu)建測序文庫時，利用Illumina高保真Taq酶將mRNA鏈的方向信息保存到測序文庫中。
服務(wù)類別：測序/合成總訪問：4396
最后更新：2015-8-19半年訪問：49
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鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序（strand-specific RNA sequencing）是指在構(gòu)建測序文庫時，利用Illumina高保真Taq酶將mRNA鏈的方向信息保存到測序文庫中。測序后的數(shù)據(jù)分析可確定轉(zhuǎn)錄本是來自正義還是反義DNA鏈。與普通轉(zhuǎn)錄組測序相比，它更能準(zhǔn)確地統(tǒng)計轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量和確定基因的結(jié)構(gòu)，同時可以發(fā)現(xiàn)更多的反義轉(zhuǎn)錄本，目前被廣泛地應(yīng)用于研究基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控等領(lǐng)域范圍。
 
技術(shù)優(yōu)勢
1. 精確度高：文庫制備和測序過程中保留了RNA方向信息，有效數(shù)據(jù)增多，從而使基因表達(dá)定量更加準(zhǔn)確。與基因組和參考基因組的比對結(jié)果，其鏈特異的結(jié)果均相近或稍高于非特異性結(jié)果。
2. 豐富度高：準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)錄本，獲取更多轉(zhuǎn)錄本相關(guān)信息，進(jìn)行鑒定分析。
 
應(yīng)用方向 
1. 模式生物基因結(jié)構(gòu)分析：
模式生物已經(jīng)有完整的基因注釋信息，但是實際研究中存在個體差異性。利用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序可以對個體表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度分析，對基因進(jìn)行重注釋。
2. 差異基因準(zhǔn)確分析：
能針對不同轉(zhuǎn)錄方向的基因進(jìn)行精確的表達(dá)量統(tǒng)計及差異表達(dá)分析，從而推斷出與功能狀態(tài)變化相關(guān)聯(lián)的候選基因，揭示差異基因的功能分類和相關(guān)代謝通路。
3. 原核生物操縱子分析：
對原核生物的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析，能更加準(zhǔn)確地進(jìn)行操縱子鑒定和分析。
 
技術(shù)路線
 
生物信息學(xué)分析
 
樣品要求
1）樣品類型：細(xì)胞、新鮮組織或RNA樣品。
2）樣品量：細(xì)胞樣品請?zhí)峁┲辽?×107個細(xì)胞，組織樣品請?zhí)峁┲辽?00mg的組織塊或切片，RNA樣品請?zhí)峁?μg以上的總RNA。
3）樣品質(zhì)量： RNA無明顯降解，提取的總RNA OD260/280值在1.8~2.2之間，濃度≥ 500 ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。
4）樣品保存：細(xì)胞樣品或新鮮組織塊（切成~50mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護(hù)劑處理或液氮凍存后，-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復(fù)凍融。
5）樣品運輸：樣品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰運輸。
 
應(yīng)用案例
Andrea Pauli, EivindValen, Michael F. Lin, et al. Systematic identification of long noncoding RNAs expressed during zebrafish embryogenesis. Genom research,2011.
本研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎形成的過程中，1133個lncRNAs轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，包括長鏈基因間非編碼RNA、內(nèi)含子重疊lncRNAs、外顯子反義重疊lncRNAs。斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的lncRNA與其他哺乳動物的lncRNA特征類似：長度短、外顯子少、表達(dá)量低。lncRNA子集攜帶發(fā)育功能相關(guān)的特定染色質(zhì)特征。lncRNA的時空表達(dá)有兩個重要特征：一是比普通蛋白表達(dá)時間寬度窄，主要富集在胚胎發(fā)育早期；二是一些lncRNA表現(xiàn)出明顯的組織特異性和特定的亞細(xì)胞定位模式。
 
研究方法：
本文采用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組的測序方法，用Illumina HiSeq 2000測序平臺，2×76bp的測序模式，對斑馬魚胚胎發(fā)育過程中l(wèi)ncRNA表達(dá)的情況進(jìn)行了研究。本研究中每個測序樣本得到200-300M reads。
 
結(jié)果分析：
1. 斑馬魚胚胎形成過程中，表達(dá)的lncRNAs的種類
2. 胚胎形成時期lncRNA表達(dá)時空特征
 
參考文獻(xiàn)
Andrea Pauli, Eivind Valen, Michael F. Lin, et al. Systematic identification of long noncoding RNAs expressed during zebrafish embryogenesis. Genom research,2011.
 
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